# 定义

含有活性微生物并对特定灭菌工艺具有明确耐热性的测试系统，简写BI

# 用途

能够定量测定和评价灭菌效果的生物检测器

适用于灭菌程序的设计、开发、验证、确认，灭菌程序的日常监测

# 种类

根据不同灭菌方式的特点，生物指示剂也有不同的形态

![1671112839029](https://file+192-002e168-002e168-002e108.vscode-resource.vscode-cdn.net/Note/%E5%88%B6%E8%8D%AF/%E5%B7%A5%E8%89%BA%E6%96%B9%E6%B3%95%E7%B1%BB%E9%AA%8C%E8%AF%81/%E7%81%AD%E8%8F%8C%E5%B7%A5%E8%89%BA/%E7%94%9F%E7%89%A9%E6%8C%87%E7%A4%BA%E5%89%82/image/%E7%94%9F%E7%89%A9%E6%8C%87%E7%A4%BA%E5%89%82/1671112839029.png)

![1671112878739](https://file+192-002e168-002e168-002e108.vscode-resource.vscode-cdn.net/Note/%E5%88%B6%E8%8D%AF/%E5%B7%A5%E8%89%BA%E6%96%B9%E6%B3%95%E7%B1%BB%E9%AA%8C%E8%AF%81/%E7%81%AD%E8%8F%8C%E5%B7%A5%E8%89%BA/%E7%94%9F%E7%89%A9%E6%8C%87%E7%A4%BA%E5%89%82/image/%E7%94%9F%E7%89%A9%E6%8C%87%E7%A4%BA%E5%89%82/1671112878739.png)

## 湿热灭菌固体生物指示

![1671112938637](image/生物指示剂/1671112938637.png)

![1671112952709](image/生物指示剂/1671112952709.png)

![1671112963896](image/生物指示剂/1671112963896.png)

# 特性

具有较高的耐受性、贮存稳定性、批与批之间的一致性、无致病性、易于培养和制备-细菌芽孢

耐受性要高于灭菌前产品中污染菌的耐受性

符合地方、国内、国际相关法规要求

可根据灭菌程序的设计要求而制备

# BI耐受性的影响因素

## 生物学种类

![1671113088853](image/生物指示剂/1671113088853.png)

## 制备孢子的培养条件

* 温度
* 培养基成分

## 孢子悬浮液的组份

## 孢子载体材料

## 灭菌后的培养条件

* 温度
* 培养基质量

# BI耐热性：D值

## 测定方法：ISO 11138-1

## 残存概率法

- 多采用水/油浴+毛细管

## 阴性分数法

- SMC法
- HSK法

## 生物指示剂耐热性测定仪

    * 方法：ISO 18472

![1671113254238](image/生物指示剂/1671113254238.png)

# 生物指示剂的关键质量参数

## 孢子数量

- 复核数量结果要在标示结果的50%~300%范围内
- 计数前需要热处理

## D值

- 复核结果要求在标示结果的±20%范围内

## 最大存活时间（用户不要求测定）

- 存活时间≥（lgN0-2）×D值

## 最小灭活时间（用户不要求测定）

- 灭活时间≤（lgN0+4）×D值

# 物理灭杀时间Fphy

* 采用物理数据（热穿透温度和时间）预测一个灭菌程序所赋予装载的灭菌效果
* 一般采集产品最冷点部位的温度（但不包括干热位置）
* 仅适用于饱和湿热条件，即不包括无饱和蒸汽的相对干燥位置
  * Fphy = Σ（10^(（T-121）÷Z)×Δt）
    * Δt：穿透温度下的过渡时间（通常为1min）
    * Z：生物指示剂的温度系数

# 标准灭菌时间F0

F0 = Σ（10^(（T-121）÷10)×Δt），Z值取10℃

* 在121℃灭菌一分钟，可看作标准状态下1分钟（1个单位）
  * F0 = Σ（10^(（121-121）÷10)×1）=1.0min
* 在118℃灭菌一分钟，与121℃灭菌的等效灭菌时间为：
  * F0 = Σ（10^(（118-121）÷10)×1）=0.5min
* 用于计算F0的温度，应取自物品内

# 生物灭杀时间Fbio

* 表示一个灭菌程序在一定温度下杀灭某种微生物的实际效果

  * Fbio = D × LR

    * D：微生物的耐热参数
    * LR：在灭菌过程中微生物数量的对数下降值，即LR= Lg（N0）-Lg（NF）

# Fbio和Fphy的一致性

* 在理想状态下，Fbio=Fphy
  * 加热和冷却曲线为矩形波
  * 每个BI的数量/耐热性和孢子的受热程序均没有差异
  * 每个产品所受到的热效应均相同
* 实际情况下，Fphy＞Fbio
  * 每个产品内的热穿透总有一些差异，会导致Fphy的差异
  * 如果估算出的Fphy与Fbio之间有很大的差异，那么将会导致BI的阳性结果
  * 验证时，可以运行最差灭菌程序条件，如降低温度或缩短保温阶段时间，最低Fphy＞Fbio
* 仅凭物理数据不能完全保证灭菌程序所赋予产品足够的灭菌效果
  * 灭菌效果与具体产品组份相关
  * 有些点可能无法采集热穿透数据，需要BI监控
* 同样，仅凭生物指示剂数据也不能保证灭菌程序的适当性和合理性
  * 物理数据还可以用来评价灭菌程序对产品质量的稳定性考察
* 生物数据与物理数据之间要相互支持

# LVP产品灭菌的工艺开发

* 问题：如何有效且科学地对以下具有相同包装（如250ml/袋）的大容量注射剂产品，进行灭菌工艺程序的开发与验证
* 可选取其中一种（或两种）溶液作为主溶液，代表同组产品进行灭菌程序的开发和验证。主溶液的选择标准

  * BI在其中具有最高耐受性-BI验证
  * 加热速度（热穿透）最难（如高粘度）-热穿透研究
* BI主溶液和热穿透主溶液可以不同
* 本次讨论主题：BI主溶液
* BI（B.subtills）在各个产品溶液中的耐热参数

  ![1671115161032](image/生物指示剂/1671115161032.png)
* LVP产品灭菌程序评估

  * 选择0.9%氯化钠注射液为同组产品灭菌工艺验证的主溶液
  * 接种枯草芽孢杆菌孢子至0.9%氯化钠注射液（100ml），形成至少108孢子/袋的含量
  * 将接有BI的容器紧挨在差有温度探头的容器
  * 运行最差灭菌程序条件，随机采集热穿透数据、F0值、Fphy值
  * 对接有BI的所有容器进行无菌检查
  * 0.9%氯化钠注射液在最差灭菌条件下的热穿透数据、Fphy和Fbio

    ![1671115175014](image/生物指示剂/1671115175014.png)
  * 计算Fbio值

    * 经检查，20个接有BI的产品均呈阴性，采用阴性分数法计算每个产品内的残存孢子时，需要假设有一个产品呈阳性
    * N0=10^8孢子/袋
    * 计算
      * NF= ln(n÷r) = ln（20÷19） = 0.0513
      * LR = LgN0 - LgNF = Lg（1×10^8）-Lg0.0513 = 9.3
      * Fbio = D ×LR = 0.66 ×9.3 = 6.1min
      * F0 = 8.4min（121℃，Z=10℃）		= Σ（10^(（T-121）÷10)×Δt）？？？
      * Fphy = 10.4min（121℃，Z=12.8℃）  ？？？怎么得来的
    * 赋予BI的估计效果
      * LR = Fphy÷D121℃ = 10.4÷0.66 = 15.75
* 数据对比

  * 如果产品的灭菌前含菌量限度控制在1000 CFU/袋，污染菌的耐热性（D121℃）空载在0.66min之内，那么，F0值为8.4min的湿热灭菌程序在产品灭菌后非无菌品的概率可估算为
  * LgNF = LgN0 - Fphy/D121 = 3.0-15.7 = -12.7
  * PNSU = NF = 10^-12.7 ＜10^-6
* 嗜热脂肪芽孢杆菌BI评价-物品特性灭菌程序

  * 产品中含有细菌芽孢的最大可能数
    * 10个孢子/产品，计算时可用100个孢子/产品（最差状况/安全空间）
  * 产品中含有戏剧芽孢的最高耐热性
    * Fbio = D121 × （LgN0 - LgNF）= 0.5 ×[lg100-lg(10^-6)] = 0.5 × [2 - (-6)] = 4min，增加安全系数，取5min作为对灭菌工艺F0值要求
  * 嗜热脂肪芽孢杆菌BI特性
    * 孢子数量，N0=2X10^6孢子/BI
  * 当孢子置于F0为5.0min的灭菌程序后，估算出其残存孢子数量
    * Fbio = D121 × （LgN0 - LgNF）
    * LgNF = lgN0 - F0 ÷ D121 = 6.3 -5 ÷ 2 = 3.8
    * NF= 10^3.8=~6.3×10^3孢子
  * 问题：只要BI孢子残存数量不超过6.3X10^3孢子，灭菌程序符合无菌保证要求？
    * BI状况：N0 = 2×10^6孢子/BI，D121 = 2.0min
    * 计算使BI数量下降至6.3×10^3孢子/BI所需的Fbio值
      * Fbio = D121 × （LgN0 - LgNF）=2.0 × [lg(2×10^6)-Lg(6.3×10^3)] = 5.0min
      * 产品污染菌状况：N0 = 100，D121 = 0.5min
      * 计算产品经F0为5.0min程序后，残存的孢子数量
      * LgNF = lgN0 - F0 ÷ D121 =2 - 5.0 ÷ 0.3 = -14.7
      * NF = PNSU = 10^-14.7＜10^-6(无菌保证标准)

# 嗜热脂肪芽孢杆菌BI用于过度灭菌工艺效力评价

## 过度杀灭嗜热灭菌工艺

- 用于带孔/固体物品的灭菌
- 灭菌效力要求
  - F0和Fbio≥12min
- 温度探头必须摆放在蒸汽最难穿透的部位
- 嗜热脂肪芽孢杆菌BI的要求
  - 孢子含量≥1X106孢子/BI
  - 耐热性D121℃≥1.5min

## 初始评价

- 物理灭杀值（20支探头），F0值16~20分钟
- 20个BI在灭菌、培养后，全部呈阴性结果
  - BI孢子起始数量2.3×10^6/BI
  - D121℃=1.8min
- 计算Fbio值
  - Fbio=D121℃×（LgN0-LgNF）=1.8×{Lg（2.3×10^6)-Lg[ln(20/19)]}=13.8min
- 最小F0值和Fbio值均大于12min

## 再评价

- 物理灭杀值（20支探头），F0值16~20分钟
- 20个BI在灭菌、培养后，18个阴性，2个阳性
  - BI孢子起始数量2.3×10^6/BI
  - D121℃=1.8min
- 计算Fbio值
  - Fbio=D121℃×（LgN0-LgNF）=1.8×{Lg（2.3×10^6)-Lg[ln(20/18)]}=13.2min
- 最小F0值和Fbio值均大于12min
- 如果要求或希望BI被全部灭杀，则
  - 延长暴热时间
  - 检查BI的z值是否小于10℃？
- 如果允许有阳性结果
  - 在每个探头至少两个BI
  - 对有阳性结果出现的位点，根据阴性分数法计算出孢子的残存量

# Z值对计算F0值的影响

- Z值是D值变化一个对数单位时，灭菌温度变化的度数，随微生物种类受热环境而变化
- 用于换算杀灭率，从而估算等效灭菌值（等效灭菌时间，Fphy值）
- 采用热穿透计算Fphy值
  - Fphy = Σ（10^(（T-121）÷Z)×Δt）
- 标准等效灭菌时间F0以121℃参照温度，Z值取10℃
- 用F0值来估测灭菌程序对BI的杀灭效果
- 当Z值不等于10℃时，Fphy值会出现什么样的变化？

# 总结

- 开发、评价和确认一个灭菌工艺程序对灭菌物品的灭菌效果时，需要同时测定Fphy值和Fbio值，并且Fphy值≥Fbio值
- Fphy值由物理和数学方法计算出来
  - 当Z值取10℃，得F0值
  - 当Z值取测试用BI的实际值，得到Fphy
- Fbio值由BI测试而计算出来
- 对组份、特性和包装相似的产品，可采用统筹法（主溶液）对全组产品的灭菌程序效果进行评价和确认