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BioP/工艺方法类验证/灭菌工艺/生物指示剂/生物指示剂.md

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定义

含有活性微生物并对特定灭菌工艺具有明确耐热性的测试系统，简写BI

用途

能够定量测定和评价灭菌效果的生物检测器

适用于灭菌程序的设计、开发、验证、确认，灭菌程序的日常监测

种类

根据不同灭菌方式的特点，生物指示剂也有不同的形态

1671112839029

1671112878739

湿热灭菌固体生物指示

1671112938637

1671112952709

1671112963896

特性

具有较高的耐受性、贮存稳定性、批与批之间的一致性、无致病性、易于培养和制备-细菌芽孢

耐受性要高于灭菌前产品中污染菌的耐受性

符合地方、国内、国际相关法规要求

可根据灭菌程序的设计要求而制备

BI耐受性的影响因素

生物学种类

1671113088853

制备孢子的培养条件

  • 温度
  • 培养基成分

孢子悬浮液的组份

孢子载体材料

灭菌后的培养条件

  • 温度
  • 培养基质量

BI耐热性：D值

测定方法：ISO 11138-1

残存概率法

  • 多采用水/油浴+毛细管

阴性分数法

  • SMC法
  • HSK法

生物指示剂耐热性测定仪

* 方法：ISO 18472

1671113254238

生物指示剂的关键质量参数

孢子数量

  • 复核数量结果要在标示结果的50%~300%范围内
  • 计数前需要热处理

D值

  • 复核结果要求在标示结果的±20%范围内

最大存活时间（用户不要求测定）

  • 存活时间≥（lgN0-2）×D值

最小灭活时间（用户不要求测定）

  • 灭活时间≤（lgN0+4）×D值

物理灭杀时间Fphy

  • 采用物理数据（热穿透温度和时间）预测一个灭菌程序所赋予装载的灭菌效果
  • 一般采集产品最冷点部位的温度（但不包括干热位置）
  • 仅适用于饱和湿热条件，即不包括无饱和蒸汽的相对干燥位置
    • Fphy = Σ（10^(（T-121）÷Z)×Δt）
      • Δt：穿透温度下的过渡时间（通常为1min）
      • Z：生物指示剂的温度系数

标准灭菌时间F0

F0 = Σ（10^(（T-121）÷10)×Δt），Z值取10℃

  • 在121℃灭菌一分钟，可看作标准状态下1分钟（1个单位）
    • F0 = Σ（10^(（121-121）÷10)×1）=1.0min
  • 在118℃灭菌一分钟，与121℃灭菌的等效灭菌时间为：
    • F0 = Σ（10^(（118-121）÷10)×1）=0.5min
  • 用于计算F0的温度，应取自物品内

生物灭杀时间Fbio

  • 表示一个灭菌程序在一定温度下杀灭某种微生物的实际效果

    • Fbio = D × LR

      • D：微生物的耐热参数
      • LR：在灭菌过程中微生物数量的对数下降值，即LR= Lg（N0）-Lg（NF）

Fbio和Fphy的一致性

  • 在理想状态下，Fbio=Fphy
    • 加热和冷却曲线为矩形波
    • 每个BI的数量/耐热性和孢子的受热程序均没有差异
    • 每个产品所受到的热效应均相同
  • 实际情况下，Fphy＞Fbio
    • 每个产品内的热穿透总有一些差异，会导致Fphy的差异
    • 如果估算出的Fphy与Fbio之间有很大的差异，那么将会导致BI的阳性结果
    • 验证时，可以运行最差灭菌程序条件，如降低温度或缩短保温阶段时间，最低Fphy＞Fbio
  • 仅凭物理数据不能完全保证灭菌程序所赋予产品足够的灭菌效果
    • 灭菌效果与具体产品组份相关
    • 有些点可能无法采集热穿透数据，需要BI监控
  • 同样，仅凭生物指示剂数据也不能保证灭菌程序的适当性和合理性
    • 物理数据还可以用来评价灭菌程序对产品质量的稳定性考察
  • 生物数据与物理数据之间要相互支持

LVP产品灭菌的工艺开发

  • 问题：如何有效且科学地对以下具有相同包装（如250ml/袋）的大容量注射剂产品，进行灭菌工艺程序的开发与验证

  • 可选取其中一种（或两种）溶液作为主溶液，代表同组产品进行灭菌程序的开发和验证。主溶液的选择标准

    • BI在其中具有最高耐受性-BI验证
    • 加热速度（热穿透）最难（如高粘度）-热穿透研究

  • BI主溶液和热穿透主溶液可以不同

  • 本次讨论主题：BI主溶液

  • BI（B.subtills）在各个产品溶液中的耐热参数

    1671115161032

  • LVP产品灭菌程序评估

    • 选择0.9%氯化钠注射液为同组产品灭菌工艺验证的主溶液

    • 接种枯草芽孢杆菌孢子至0.9%氯化钠注射液（100ml），形成至少108孢子/袋的含量

    • 将接有BI的容器紧挨在差有温度探头的容器

    • 运行最差灭菌程序条件，随机采集热穿透数据、F0值、Fphy值

    • 对接有BI的所有容器进行无菌检查

    • 0.9%氯化钠注射液在最差灭菌条件下的热穿透数据、Fphy和Fbio

      1671115175014

    • 计算Fbio值

      • 经检查，20个接有BI的产品均呈阴性，采用阴性分数法计算每个产品内的残存孢子时，需要假设有一个产品呈阳性
      • N0=10^8孢子/袋
      • 计算
        • NF= ln(n÷r) = ln（20÷19） = 0.0513
        • LR = LgN0 - LgNF = Lg（1×10^8）-Lg0.0513 = 9.3
        • Fbio = D ×LR = 0.66 ×9.3 = 6.1min
        • F0 = 8.4min（121℃，Z=10℃） = Σ（10^(（T-121）÷10)×Δt）？？？
        • Fphy = 10.4min（121℃，Z=12.8℃） ？？？怎么得来的
      • 赋予BI的估计效果
        • LR = Fphy÷D121℃ = 10.4÷0.66 = 15.75

  • 数据对比

    • 如果产品的灭菌前含菌量限度控制在1000 CFU/袋，污染菌的耐热性（D121℃）空载在0.66min之内，那么，F0值为8.4min的湿热灭菌程序在产品灭菌后非无菌品的概率可估算为
    • LgNF = LgN0 - Fphy/D121 = 3.0-15.7 = -12.7
    • PNSU = NF = 10^-12.7 ＜10^-6

  • 嗜热脂肪芽孢杆菌BI评价-物品特性灭菌程序

    • 产品中含有细菌芽孢的最大可能数
      • 10个孢子/产品，计算时可用100个孢子/产品（最差状况/安全空间）
    • 产品中含有戏剧芽孢的最高耐热性
      • Fbio = D121 × （LgN0 - LgNF）= 0.5 ×[lg100-lg(10^-6)] = 0.5 × [2 - (-6)] = 4min，增加安全系数，取5min作为对灭菌工艺F0值要求
    • 嗜热脂肪芽孢杆菌BI特性
      • 孢子数量，N0=2X10^6孢子/BI
    • 当孢子置于F0为5.0min的灭菌程序后，估算出其残存孢子数量
      • Fbio = D121 × （LgN0 - LgNF）
      • LgNF = lgN0 - F0 ÷ D121 = 6.3 -5 ÷ 2 = 3.8
      • NF= 10^3.8=~6.3×10^3孢子
    • 问题：只要BI孢子残存数量不超过6.3X10^3孢子，灭菌程序符合无菌保证要求？
      • BI状况：N0 = 2×10^6孢子/BI，D121 = 2.0min
      • 计算使BI数量下降至6.3×10^3孢子/BI所需的Fbio值
        • Fbio = D121 × （LgN0 - LgNF）=2.0 × [lg(2×10^6)-Lg(6.3×10^3)] = 5.0min
        • 产品污染菌状况：N0 = 100，D121 = 0.5min
        • 计算产品经F0为5.0min程序后，残存的孢子数量
        • LgNF = lgN0 - F0 ÷ D121 =2 - 5.0 ÷ 0.3 = -14.7
        • NF = PNSU = 10^-14.7＜10^-6(无菌保证标准)

嗜热脂肪芽孢杆菌BI用于过度灭菌工艺效力评价

过度杀灭嗜热灭菌工艺

  • 用于带孔/固体物品的灭菌
  • 灭菌效力要求
    • F0和Fbio≥12min
  • 温度探头必须摆放在蒸汽最难穿透的部位
  • 嗜热脂肪芽孢杆菌BI的要求
    • 孢子含量≥1X106孢子/BI
    • 耐热性D121℃≥1.5min

初始评价

  • 物理灭杀值（20支探头），F0值16~20分钟
  • 20个BI在灭菌、培养后，全部呈阴性结果
    • BI孢子起始数量2.3×10^6/BI
    • D121℃=1.8min
  • 计算Fbio值
    • Fbio=D121℃×（LgN0-LgNF）=1.8×{Lg（2.3×10^6)-Lg[ln(20/19)]}=13.8min
  • 最小F0值和Fbio值均大于12min

再评价

  • 物理灭杀值（20支探头），F0值16~20分钟
  • 20个BI在灭菌、培养后，18个阴性，2个阳性
    • BI孢子起始数量2.3×10^6/BI
    • D121℃=1.8min
  • 计算Fbio值
    • Fbio=D121℃×（LgN0-LgNF）=1.8×{Lg（2.3×10^6)-Lg[ln(20/18)]}=13.2min
  • 最小F0值和Fbio值均大于12min
  • 如果要求或希望BI被全部灭杀，则
    • 延长暴热时间
    • 检查BI的z值是否小于10℃？
  • 如果允许有阳性结果
    • 在每个探头至少两个BI
    • 对有阳性结果出现的位点，根据阴性分数法计算出孢子的残存量

Z值对计算F0值的影响

  • Z值是D值变化一个对数单位时，灭菌温度变化的度数，随微生物种类受热环境而变化
  • 用于换算杀灭率，从而估算等效灭菌值（等效灭菌时间，Fphy值）
  • 采用热穿透计算Fphy值
    • Fphy = Σ（10^(（T-121）÷Z)×Δt）
  • 标准等效灭菌时间F0以121℃参照温度，Z值取10℃
  • 用F0值来估测灭菌程序对BI的杀灭效果
  • 当Z值不等于10℃时，Fphy值会出现什么样的变化？

总结

  • 开发、评价和确认一个灭菌工艺程序对灭菌物品的灭菌效果时，需要同时测定Fphy值和Fbio值，并且Fphy值≥Fbio值
  • Fphy值由物理和数学方法计算出来
    • 当Z值取10℃，得F0值
    • 当Z值取测试用BI的实际值，得到Fphy
  • Fbio值由BI测试而计算出来
  • 对组份、特性和包装相似的产品，可采用统筹法（主溶液）对全组产品的灭菌程序效果进行评价和确认