# 药学研究

物质间相互作用

## API

## API相关杂质

稳定性评价变化

## 工艺相关杂质

## 外来杂质

# 杂质研究

最后是要出一份安全性评估报告

酶切位点

强制降解

高温

强酸、碱

酶切

氧化

# 稳定性

分子变化

分子间的相互作用

# 工艺过程需要控制的杂质

原辅料

工程菌

TRIS

消泡剂

盐酸四环素


# 外来污染物

内毒素

微限

# 包装材料溶出物

相容性研究范畴

# 产品相关杂质

属主来源

聚合、断裂


相关蛋白

高分子蛋白

- 名称：人生长激素（rhGH）
- 分子式：C990H1528N262O300S7
- 氨基酸组成：

  - 氨基酸数量：191个
  - 二硫键数量：2个
  - ![](media/1b68a6fd3f7581e53e5702809957753f.jpeg)氨基酸序列（来源药典）：

> □

- 分子量：22 KD

  - 等电点（pH）：5.2
  - 宿主菌：大肠杆菌
  - 分泌部位：

    - 膜内分泌、膜外表达
    - 细胞基质，破壁不破膜
  - 紫外最大吸收波长：276nm
- 杂质成分

  - 细胞来源污染物

    - 相关蛋白质
    - 高分子蛋白质
- 工艺步骤简述

  - 一级培养
  - 二级培养
  - 种子罐培养
  - 发酵罐培养
  - 冻结
  - 融化
  - 保存
  - 裂解离心
- 步骤

  - 敲碎

    - 裂解



> 裂解液缓冲液

> ◊ 10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH7.5±0.5

- 缓冲液用量

  □ 菌体质量：缓冲液体积=1kg：8L

□

- 超滤浓缩
- 将敲碎后的菌体加入裂解缓冲液
- 搅拌时长：≥1h

  离心
- 温度：4℃
- 离心力：5324g
- 留存：上清液



- 盐析



> 超滤膜包孔径：5KD

> 一次盐析

- 目的：使蛋白沉淀出来

  □ 温度：2℃\~8℃
- 硫酸铵用量：45%，227g硫酸铵/L浓缩液
- 时长：12h以上（生产排班需求）

  - 一次离心

    - 目的：使蛋白沉淀与杂质溶液分离

      □ 温度：4℃

      □ 离心力：9915g

      - 时长：30min
      - 留存：蛋白沉淀
    - 蛋白溶解

      - 目的：使蛋白沉淀溶解
      - 溶解液：10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH 8.0±0.2
    - 二次盐析

      - 目的：使杂蛋白沉淀出来

        □ 温度：2℃\~8℃
      - 硫酸铵用量：20%，114g硫酸铵/L浓缩液

        □ 时长：0.5h\~1h
    - 二次离心
- G25



- 目的：使目的蛋白溶液与杂质蛋白沉淀分离

  □ 温度：4℃

  □ 离心力：9915g
- 时长：30min
- 留存：上清液

  目的
- 将样品中的盐脱去
- 层析原理

  - 分子筛
  - 填料性质

    - 名称：Sephadex G 25
  - 缓冲液

    - 平衡缓冲液、洗脱缓冲液

      - 10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH 8.0±0.2
  - 最终蛋白质缓冲体系

    □ 1
- DEAE1
- 层析原理

□

- 目的

□

> 离子交换（弱阴离子交换）

> 捕获目的蛋白

- 填料性质

  - 名称：DEAE Sephrose F.F
  - 缓冲液

    - 平衡缓冲液

      - 0.3mol/L Tris-HCl-30m mol/L EDTA
      - 0.04mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
    - 样品调节缓冲液

      - 0.04mol/L NaCl -10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
    - 冲洗缓冲液

      - 0.04mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
    - 洗脱缓冲液
- Phenyl
- 0.1mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
- 层析原理

  - 疏水
  - 填料性质

    - 名称：Phenyl Sepharose F.F
  - 缓冲液

    - 平衡缓冲液

      - 0.7mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
    - 样品调节缓冲液？？？

      - 3.5mol/L (NH4)2SO4溶液、1mol/L Tris-HCl-100mmol/L EDTA
    - 冲洗缓冲液

      - 0.7mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
    - 洗脱液

      - 0.5mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
      - 0.35mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
      - 0.05mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
- 盐析（去除硫酸铵、Tris，缩小体积）
- 盐析

□

□

□

□

> 目的：使蛋白沉淀出来温度：？

> 硫酸铵用量：3.5mol/L硫酸铵溶液→硫酸铵终浓度：1.35mol/L～1.83mol/L
> 时长：10min

- 一次离心

  - 目的：使蛋白沉淀与杂质溶液分离

    □ 温度：4℃

    □ 离心力：9910g

    - 时长：30min
    - 留存：蛋白沉淀
  - 蛋白溶解

    - 目的：使蛋白沉淀溶解
    - 溶解液：5m mol/L PB pH 7.2±0.1
    - 蛋白浓度：35mg/ml\~50mg/ml
  - 二次离心

    - 目的：使目的蛋白溶液与杂质蛋白沉淀分离

      □ 温度：4℃

      □ 离心力：9910g
- S-100
- 时长：15min
- 留存：上清液
- 层析原理

  - 分子筛
  - 填料性质

    - 名称：Sephacryl S100 H.R
    - 排阻范围：1\~100KD
  - 缓冲液

    - 平衡缓冲液、洗脱缓冲液



- 步骤

  - 平衡

    - 上样
    - 洗脱
    - 收集

  1. mol/L NaCl-5m mol/L PB
- DEAE2
- 目的

□

> 捕获目的蛋白

- 层析原理

  - 离子交换（弱阴离子交换）

    - 填料性质

      - 名称：DEAE Sephrose F.F
      - 缓冲液

        - 平衡缓冲液

          - 200m mol/L PB
          - 5m mol/L PB
        - 样品调节缓冲液

          - 5m mol/L PB
        - 冲洗缓冲液

          - 5m mol/L PB
        - 洗脱缓冲液

          - 0.02mol/L NaCl-5m mol/L PB
          - 0.05mol/L NaCl-5m mol/L PB
          - 0.08mol/L NaCl-5m mol/L PB
- 超滤浓缩
- 目的

□

- 原理

□

> 洗滤除去小分子的盐离子，浓度目的蛋白目的蛋白不能通过超滤膜

- 超滤膜包
- 材质



- 孔径



> 聚醚砜

> 5KD

- 单块膜包有效面积
- 0.5m2

  - 最终蛋白缓冲体系

    - G25脱盐（水剂）

      - 层析原理
- 层析柱的装填

  - 好的层析柱装填→好的层析柱→好的结果
- Q&A

○

○

○

> 有的核酸蛋白检测仪不稳定，示数经常漂移，不同的核酸蛋白检测仪测出来的柱效不一样，应该以更稳定的蛋白仪测出的柱效为准？或设备条件？

> TE溶液的配制为什么需要通过浓硫酸调节pH，是否有其他方式，减少用危险化学用品的使用为什么粗纯缓冲液用TE，精纯缓冲液用PB

白性质
