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test/海济工艺/杂质研究.md

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2 years ago
# 药学研究
物质间相互作用
## API
## API相关杂质
稳定性评价变化
## 工艺相关杂质
## 外来杂质
# 杂质研究
最后是要出一份安全性评估报告
酶切位点
强制降解
高温
强酸、碱
酶切
氧化
# 稳定性
分子变化
分子间的相互作用
# 工艺过程需要控制的杂质
原辅料
工程菌
TRIS
消泡剂
盐酸四环素
# 外来污染物
内毒素
微限
# 包装材料溶出物
相容性研究范畴
# 产品相关杂质
属主来源
聚合、断裂
相关蛋白
高分子蛋白
- 名称：人生长激素（rhGH）
- 分子式：C990H1528N262O300S7
- 氨基酸组成：
- 氨基酸数量：191个
- 二硫键数量：2个
- ![](media/1b68a6fd3f7581e53e5702809957753f.jpeg)氨基酸序列（来源药典）：
> □
- 分子量：22 KD
- 等电点（pH）：5.2
- 宿主菌：大肠杆菌
- 分泌部位：
- 膜内分泌、膜外表达
- 细胞基质，破壁不破膜
- 紫外最大吸收波长：276nm
- 杂质成分
- 细胞来源污染物
- 相关蛋白质
- 高分子蛋白质
- 工艺步骤简述
- 一级培养
- 二级培养
- 种子罐培养
- 发酵罐培养
- 冻结
- 融化
- 保存
- 裂解离心
- 步骤
- 敲碎
- 裂解
> 裂解液缓冲液
> ◊ 10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH7.5±0.5
- 缓冲液用量
□ 菌体质量：缓冲液体积=1kg：8L
□
- 超滤浓缩
- 将敲碎后的菌体加入裂解缓冲液
- 搅拌时长：≥1h
离心
- 温度：4℃
- 离心力：5324g
- 留存：上清液
- 盐析
> 超滤膜包孔径：5KD
> 一次盐析
- 目的：使蛋白沉淀出来
□ 温度：2℃\~8℃
- 硫酸铵用量：45%，227g硫酸铵/L浓缩液
- 时长：12h以上（生产排班需求）
- 一次离心
- 目的：使蛋白沉淀与杂质溶液分离
□ 温度：4℃
□ 离心力：9915g
- 时长：30min
- 留存：蛋白沉淀
- 蛋白溶解
- 目的：使蛋白沉淀溶解
- 溶解液：10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH 8.0±0.2
- 二次盐析
- 目的：使杂蛋白沉淀出来
□ 温度：2℃\~8℃
- 硫酸铵用量：20%，114g硫酸铵/L浓缩液
□ 时长：0.5h\~1h
- 二次离心
- G25
- 目的：使目的蛋白溶液与杂质蛋白沉淀分离
□ 温度：4℃
□ 离心力：9915g
- 时长：30min
- 留存：上清液
目的
- 将样品中的盐脱去
- 层析原理
- 分子筛
- 填料性质
- 名称：Sephadex G 25
- 缓冲液
- 平衡缓冲液、洗脱缓冲液
- 10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH 8.0±0.2
- 最终蛋白质缓冲体系
□ 1
- DEAE1
- 层析原理
□
- 目的
□
> 离子交换（弱阴离子交换）
> 捕获目的蛋白
- 填料性质
- 名称：DEAE Sephrose F.F
- 缓冲液
- 平衡缓冲液
- 0.3mol/L Tris-HCl-30m mol/L EDTA
- 0.04mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
- 样品调节缓冲液
- 0.04mol/L NaCl -10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
- 冲洗缓冲液
- 0.04mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
- 洗脱缓冲液
- Phenyl
- 0.1mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
- 层析原理
- 疏水
- 填料性质
- 名称：Phenyl Sepharose F.F
- 缓冲液
- 平衡缓冲液
- 0.7mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
- 样品调节缓冲液？？？
- 3.5mol/L (NH4)2SO4溶液、1mol/L Tris-HCl-100mmol/L EDTA
- 冲洗缓冲液
- 0.7mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
- 洗脱液
- 0.5mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
- 0.35mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
- 0.05mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
- 盐析（去除硫酸铵、Tris，缩小体积）
- 盐析
□
□
□
□
> 目的：使蛋白沉淀出来温度：？
> 硫酸铵用量：3.5mol/L硫酸铵溶液→硫酸铵终浓度：1.35mol/L～1.83mol/L
> 时长：10min
- 一次离心
- 目的：使蛋白沉淀与杂质溶液分离
□ 温度：4℃
□ 离心力：9910g
- 时长：30min
- 留存：蛋白沉淀
- 蛋白溶解
- 目的：使蛋白沉淀溶解
- 溶解液：5m mol/L PB pH 7.2±0.1
- 蛋白浓度：35mg/ml\~50mg/ml
- 二次离心
- 目的：使目的蛋白溶液与杂质蛋白沉淀分离
□ 温度：4℃
□ 离心力：9910g
- S-100
- 时长：15min
- 留存：上清液
- 层析原理
- 分子筛
- 填料性质
- 名称：Sephacryl S100 H.R
- 排阻范围：1\~100KD
- 缓冲液
- 平衡缓冲液、洗脱缓冲液
- 步骤
- 平衡
- 上样
- 洗脱
- 收集
1. mol/L NaCl-5m mol/L PB
- DEAE2
- 目的
□
> 捕获目的蛋白
- 层析原理
- 离子交换（弱阴离子交换）
- 填料性质
- 名称：DEAE Sephrose F.F
- 缓冲液
- 平衡缓冲液
- 200m mol/L PB
- 5m mol/L PB
- 样品调节缓冲液
- 5m mol/L PB
- 冲洗缓冲液
- 5m mol/L PB
- 洗脱缓冲液
- 0.02mol/L NaCl-5m mol/L PB
- 0.05mol/L NaCl-5m mol/L PB
- 0.08mol/L NaCl-5m mol/L PB
- 超滤浓缩
- 目的
□
- 原理
□
> 洗滤除去小分子的盐离子，浓度目的蛋白目的蛋白不能通过超滤膜
- 超滤膜包
- 材质
- 孔径
> 聚醚砜
> 5KD
- 单块膜包有效面积
- 0.5m2
- 最终蛋白缓冲体系
- G25脱盐（水剂）
- 层析原理
- 层析柱的装填
- 好的层析柱装填→好的层析柱→好的结果
- Q&A
○
○
○
> 有的核酸蛋白检测仪不稳定，示数经常漂移，不同的核酸蛋白检测仪测出来的柱效不一样，应该以更稳定的蛋白仪测出的柱效为准？或设备条件？
> TE溶液的配制为什么需要通过浓硫酸调节pH，是否有其他方式，减少用危险化学用品的使用为什么粗纯缓冲液用TE，精纯缓冲液用PB
白性质