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--- a/切向流过滤.md
+++ b/切向流过滤.md
@ -0,0 +1,19 @@
 -   切向流
    -   定义
        -   流体的流动方向与过滤方向呈垂直方向的过滤形式
        -   ![](media/ec75ed2827168470b86b5c5e24158775.jpeg)剪切力：流体流动时与膜产生的摩擦力
 >   □
 -   ![](media/a75c444f0913fa5abf4626d3b2060c85.jpeg)传统的液体过滤方式为死端过滤，也叫垂直过滤，较切向流易堵，处理量不
    如切向流
 分类
 纳滤
 超滤
--- a/切向流过滤Q&A.md
+++ b/切向流过滤Q&A.md
@ -0,0 +1,5 @@
 -   Q&A
    -   超滤能除热原，能不能用于除菌过滤？
    -   超滤系统验证需要座什么项目？
--- a/切向流过滤的用途.md
+++ b/切向流过滤的用途.md
@ -0,0 +1,20 @@
 -   切向流过滤的用途
    -   分离：
        -   澄清：
        -   浓缩：小分子透过半透膜，大分子被截留一直循环浓缩
        -   脱盐：盐类小分子透过半透膜，大分子被截留一直循环浓缩
        -   更换缓冲体系：缓冲体系中的溶质小分子透过半透膜，大分子被截留一直循
            环浓缩
        -   除热原：热原小分子透过半透膜，大分子被截留一直循环浓缩
    -   切向流的过滤类型
        -   不同分子尺寸对应的方法
 >   ![](media/e2a10d72088caf74f26de67e039db6f1.jpeg)□
--- a/切向流过滤系统构成.md
+++ b/切向流过滤系统构成.md
@ -0,0 +1,6 @@
 -   切向流过滤系统构成
 >   
 >   
--- a/层析原理/亲和层析.md
+++ b/层析原理/亲和层析.md
@ -0,0 +1,388 @@
 >   亲和层析
 >   2021年6月24日 21:50
 -   亲和层析
    -   基本原理
        ◊ 定 义
        ◊ 通过生物分子之间的特异性的识别并相互作用来分离纯化物质
        ◊ 如酶和底物、抗原和抗体之间专一的相互作用
        ◊ 将其一作为配基固定在填料上，就可以从初始样品中吸附相应的生物分子，
        通过洗脱将其解离达到纯化的目的
        ◊ 优势特点
        ◊ 能够完成一般方法很难完成的分离
        ◊ 经常可以一步达＞90%的纯度
        ◊ 高选择性
        ◊ 高分辨率
        ◊ 高结合载量
        ◊ 快速将目标蛋白与大量杂质分离
        ◊ 填料结构
        ![](media/09cc0ebf1fa0829200128d07bc9a250f.jpeg)◊ 较长的间隔臂
 
 -   层析步骤
    ![](media/03f846d5ecdb41d44b71356f69f4a7f0.jpeg)◊ 一般操作步骤和层析图谱
 >   ◊
 >   ◊ 上样前的样品优化
 >   ◊ 加强目的分子与配基之间的特异性亲和力
 >    上样前，过滤或离心样品以去除颗粒性固体成分
 >    调节样品的pH、盐浓度和添加剂来提高结合的效率
 >    通过脱盐柱置换缓冲液，去除能影响结合的物质
 >   ◊ 样品洗脱方式
 >   ◊ 打破目的分子和配基之间的亲和力
 >    常规洗脱
 -   改变缓冲液的组成
    -   高盐洗脱
 ![](media/86136ced187b0f8c24d0816c16ef861c.jpeg)
 -   使用极端pH或者变性剂
    -   ![](media/76a2290d09d38afe0f53d7e14f31a2ae.jpeg)低pH缓冲液冲洗抗体
 
 >    竞争洗脱
 -   ![](media/0b061ab0927a8e868aea07b305af454d.jpeg)加入目的分子类似物
 >   
 -   加入配基类似物
 ![](media/9418a67cab428d4977dddd8fef8b5b9e.jpeg)
 >   ![](media/77692f49707eec82597eda4d52c546fe.jpeg) 图 片
 –
 -   应用举例
    ◊ 标签蛋白亲和层析
    ![](media/00c77d3f4a435d6447c7b197f6c99ff0.jpeg)◊ 基本原理
 >   
 >   ◊ 亲和标签的种类
 >    短肽类小标签
 >    大标签
 >    双标签
 >   ![](media/1d9663f840ce948595d9e82188ead820.jpeg) 图 片
 –
 >   ◊ His标签蛋白的纯化
 >   ![](media/175df3abf854007bb039039422fcd423.jpeg)
 >   Ni填料结构和His标签亲和原理
 –
 >    常规的His标签蛋白纯化填料
 ![](media/abef10bbd45bd4636682ce2afba2d4f2.jpeg)
 >    结合液咪唑浓度的摸索
 -   ![](media/1b5cef49b199ffde751b81855b2ab330.jpeg)Ni填料离心柱快速筛选
 
 -   ![](media/22436fd7b8de8c152239b1b984798445.jpeg)预装柱线性梯度洗脱
 
 >   ![](media/5ba89020a7c2da8cfb82d8ea69716227.jpeg)
 >   Ni柱之后的精纯（一般接分子筛）
 >   –
 >    Ni Sepharose excel
 -   ![](media/dc1eefbd0e911ed14ea749270eda0bbc.jpeg)用于纯化大体积分泌蛋白
 
 -   ![](media/e52f487eed9751de9c4dec5463cd434a.jpeg)耐酸耐碱、耐EDTA、耐还原剂
 
 >    金属离子的筛选
 -   ![](media/2041b079594f533dddc968bd96fffc6d.jpeg)IMAC Sepharose
 
 >   ![](media/5ed329d81a3258f0ab95010dbada655e.jpeg) TALON Superflow-纯度最高
 >   –
 >   ◊ Strep（Ⅱ）和两联Strep（Ⅱ）标签蛋白的纯化
 >    原理和介绍
 ![](media/ae05692ce62d9b89e14e651311c4d9c5.jpeg)
 >   ![](media/714c91576f65c9afdc09bdde0e74ddb4.jpeg) 原理及特点
 –
 >   ![](media/70f0eb46b47b84f161d3b8accdb7e0ab.jpeg) 纯化实例
 –
 >   ◊ GST标签蛋白的纯化
 >   ![](media/eac9eae7882f7ebc365ca73e00c86695.jpeg) 填料结构和亲和原理
 –
 >   ![](media/25c5e5c206497ff8567306664860f62b.jpeg) 特 点
 –
 >   ![](media/54f6cd3de7e0cc89820aac1216470886.jpeg) GST填料的结合和洗脱
 –
 >   ![](media/f462fad244c05827ff3aadb9f553d336.jpeg) 填料的种类
 –
 >   ![](media/e6623c44409dc14d25efb617e2356aac.jpeg) GST标签的酶切
 –
 >    使用PreScission酶对GST标签蛋白进行柱上酶切
 >   –
 >    洗脱后酶切前的分子筛精纯
 -   ![](media/0c597b24eaa7ec99c099ff07ab43f4b7.jpeg)去除且不开的高聚组份
 
 >    其他条件优化
 -   ![](media/3d7f4a0f1fe5070dc76910f2094f4ff2.jpeg)降低上样流速有利于目的分子结合
 
 -   ![](media/1fad7981f6544e5ae766f2967c3364fa.jpeg)提高样品浓度有利于目的分子结合
 
 >    杂质对于纯度的影响
 -   ![](media/ac20cd471b9a7094cdb88ece265a58db.jpeg)杂质可能结合目的蛋白而非GST标签和GST层析柱
 
 >   ![](media/efbb64164bceb18517464391582a6025.jpeg)
 >   Cytiva全流程GST标签融合蛋白解决方案
 >   –
 >   ◊ MBP标签蛋白的纯化
 >   ![](media/562b5e9737f3e57505534762f6b73035.jpeg) 填料结构和亲和原理
 >   –
 >    特 点
 ![](media/7e4b66f87f473a9ba342babc90fef564.jpeg)
 >   ![](media/030fd5b84b0f28c86753cfa70705c2de.jpeg) 纯化实例
 –
 >    双标签蛋白的纯化
 -   ![](media/977a5f00387506c2c3b9eeb968c40c88.jpeg)N和C端各连接一个标签
 
 >   ◊ 抗体亲和层析
 >   ![](media/6420f96db0121f2a3fbcef3adad11def.jpeg)◊ 抗体的结构
 >   
 >   ![](media/9ba7869ecdf1d0ea12e32c8a444382b8.jpeg)◊ Protein G填料特点
 >   
 >   ![](media/e6cfcb6795e9f28dd80a00826637bbca.jpeg)◊ Protein A填料特点
 >   
 >   ![](media/fa218414bf06ed66536f477f04891a68.jpeg)◊ Protein A和Protein
 >   G蛋白与抗体亚型的亲和力
 >   
 >   ◊ MabSelect家族
 >   ![](media/f8815e1d53fb096e34d5a14a007a99c2.jpeg) 发展历史
 –
 >    不同比较
 ![](media/2c26a59d353695dbdb571b8e6719e858.jpeg)
 >    MabSelect PrismA综合性能最佳
 -   ![](media/a7b279c2dab74ae0e9ef5302909aeec0.jpeg)对人lgG可达80mg/ml载量
 
 -   ![](media/6a5af150329514708197e9980ffea7bb.jpeg)碱洗CIP300循环下仍可保持高载量
 
 -   ![](media/3c3f9cdaeaed5088d2376e4b703aa446.jpeg)强碱NaOH对层析填料的清晰效果
 
 -   ![](media/3bdcf4eeb08b88688a36061db135afe0.jpeg)图片
 
 >   ![](media/e61f6955a610908ffd815a6ceae88c2a.jpeg)◊ 耐碱配基的研发过程
 >   
 >   ◊ 纯化实例
 >    Protein A填料
 -   ![](media/3552600d4f8efc9898b742776a5d8293.jpeg)图谱和电泳
 
 -   ![](media/c029b49781be55d79a438ce22958588a.jpeg)pH和离子强度的优化
 
 >    Protein G填料
 -   图谱和电泳
 ![](media/760fff92528793e2a9ef74f402a7c10f.jpeg)
 >   ![](media/beb3f665ccf3eeacbe22f17ff99957ac.jpeg) 耐碱的MabSelect SuRe填料
 –
 >   ![](media/b9d753b9d557ad2bbf219a8590e28473.jpeg) 耐碱的载量最高的MabSelect
 >   PrismA填料
 –
 >   ![](media/d7850d6ee107477a5558c38f9290730a.jpeg)◊ 工业生产工艺路线
 >   
 >   ◊ 抗体片段亲和层析
 >   ![](media/f3a5fc7603fb91fd570d55591360a0a9.jpeg) 抗体片段的结构
 –
 >    Capto L填料
 -   ![](media/c09a25deff5a5bb926142f331fcc6bca.jpeg)配基为Protein L
 
 -   ![](media/8365e201ed91e910f69467c8992ea28e.jpeg)实例
 
 >   ![](media/fe41754961114efe08662c9415f8a2b5.jpeg) 替代方案
 –
 >    KappaSelect&LambdaFabSelect填料
 ![](media/6d593fe3229dfb15cc56470c2a42e386.jpeg)–
 >   ![](media/811ba8c720ba91537816afdf320908df.jpeg)◊ lgM的纯化
 
 >   ![](media/61198a2fb9b74193636be23b760079c5.jpeg)◊ lgY的纯化
 
 >   ◊ 族特异亲和层析
 >   ![](media/3306d2df0eb799c087c598c5b7ec01ba.jpeg)◊ 填料的种类
 
 >   ![](media/334a790a843737670b3201cc2eb1c74c.jpeg)◊ Con A和Lentil
 >   Lectin填料捕获含多糖物质
 
 >   ![](media/e6376da7fa268e944dc3d5e1df312515.jpeg)◊ 细胞外膜蛋白质组的提取
 
 >   ◊ 预活化亲和层析
 >   ![](media/c7284ecccdc6348cd40a329e83d7c640.jpeg)◊
 >   预活化填料共价偶联配基去吸附目标分子
 
 >   ![](media/a7ee78ae3c5f8920c5e0ace5a887ddb0.jpeg)◊ 填料的特点
 
 >   ◊ 利用TNF-α的抗体片段作为配基纯化TNF-α
 >   ![](media/d13a2dabb8f714cacd11329217f5c961.jpeg)
 >   ![](media/3cd32f425a559da6aea04446eea91e07.jpeg)◊
 >   草酸作为配基从肾脏中垂钓草酸结合蛋白
 >   
 >   ![](media/323b3b98c76ee3f35f0cbef91600cd50.jpeg)
--- a/层析原理/凝胶过滤层析.md
+++ b/层析原理/凝胶过滤层析.md
@ -0,0 +1,15 @@
 -   凝胶过滤层析（又称分子筛、分子排阻）
    -   构成
        ◊ 柱形：瘦高
        ◊ 填料：多孔球状基架
        ◊ 颗粒直径范围：8.6\~200μm
        ◊ 材质：交联的多糖
        ![](media/6b1c1513dcf1e561b6aa9a56c66853f9.jpeg)◊ 图 片
 ◊
--- a/层析原理/分子筛.md
+++ b/层析原理/分子筛.md
@ -0,0 +1,220 @@
 >   分子筛
 >   2021年6月24日 19:45
 -   凝胶过滤层析（又称分子筛、分子排阻）
    -   构成
        ◊ 柱形：瘦高
        ◊ 填料：多孔球状基架
        ◊ 颗粒直径范围：8.6\~200μm
        ◊ 材质：交联的多糖
        ![](media/307966641ed5c3816041cdf4132a341e.jpeg)◊ 图 片
 ◊
 -   分离原理
    ◊ 根据分子大小和形状的差异进行分离的一种简单可靠的层析技术
    ![](media/e80fa17cdb16a6fd774bc767a40b0f31.jpeg)◊ 图 片
 ◊
 -   分离特点
    ◊ 分子量、形状、体积大小影响进孔能力及出峰体积
    ◊ 大分子先出，小分子后出
    ◊ 提高选择性和柱效
    ◊ 只需要一种缓冲液
    ◊ 容易操作
    ◊ 凝胶过滤
    ◊ 脱盐置换缓冲液
    ◊ 体积排阻
    ◊ 分子量相差2倍以上，分离效果才会好
    ◊ 蛋白质溶液脱盐
    ◊ 添加到150mM NaCl的盐到流动相中以消除分子和填料间的作用对结果的干扰
    ◊ 蛋白复性
    -   层析步骤
        ◊ 平衡→上样→洗脱→清洗/保存
    -   层析图谱
 ![](media/385d68dbc6250546154eca91de9af60d.jpeg)
 -   相关特性
    ![](media/3d15099b5287bc9b0b6196afb37ecf2f.jpeg)◊
    样品的分子量Mr与出峰体积Ve一一对应
 >   ◊
 >   ![](media/cd72f6910155ca63fcd1092430a456aa.jpeg)◊
 >   样品分子量Mr决定样品的入孔能力系数Kd
 >   ◊
 >   ◊ 样品分子量Mr与出峰体积Ve（入孔能力Kav）之间的关系
 ![](media/9317554c943867e938f1df8257bf7903.jpeg)
 >   ![](media/76b65190af62629c1edabe3451db3c35.jpeg)◊
 >   凝胶过滤层析填料的分离范围：a值
 >   ◊
 >   ![](media/538c6e3fc20784bd32f0012bce356de3.jpeg)◊
 >   凝胶过滤层析填料的分辨率（选择性）：b值
 >   ◊
 >   ◊ 凝胶过滤层析填料的a值和b值的拟合测定
 >   ![](media/c80e2b79048a08c26dfa1cb960af1d86.jpeg)◊
 -   凝胶过滤层析的条件优化（影响因素）
    ![](media/31bd126911bbf43ac048a11687a4f21e.jpeg)◊ 填料的孔径与选择性
 >   ◊
 >   ![](media/c94f7826bb8e22e6621569d4a4b36118.jpeg)◊ 柱高与分辨率（选择性）
 >   ◊
 >   ◊ 运行流速与峰宽（有效性）-影响因素
 ![](media/00a9a48797b825657ee7c79c0f35329e.jpeg)
 >   ![](media/70c8dc150067d92e07baff8977fb54a3.jpeg)◊
 >   运行流速与峰宽（有效性）-层析速率方程
 >   ◊
 >   ![](media/7308f8e1488baae1cc3a6bfe177a93bc.jpeg)◊
 >   运行流速与峰宽（有效性）-实例
 >   ◊
 >   ◊ 填料的粒径与选择性
 ![](media/7f8f93c110453f83f8108933e7471bbb.jpeg)
 >   ![](media/d498424d8e5066f7c485a3ba84562622.jpeg)◊ 填料的装填柱效与有效性
 >   ◊
 >   ![](media/c12621323f5e9b2090a083b54e80c107.jpeg)◊ 上样体积和上样浓度
 >   ◊
 >   ◊ 样品和缓冲液的粘度
 ![](media/7675badbac0a2b5e1c681d166baa8c73.jpeg)
 >   ![](media/77d2478ce5f4d89db4ac7ab1d5278671.jpeg)◊ 缓冲液的成分
 ◊
 >   ![](media/e58c77e80df03b40417f991a13a5cea7.jpeg)◊ 层析柱接线管路的长度和直径
 ◊
 -   主要作用
    ◊ 蛋白精纯、样品筛选鉴定、疫苗纯化和质控、样品换液
    -   常见凝胶过滤应用及填料选择
        ◊ S 系
 >   ![](media/c26cdace70b727e7dc29210d46b83bf1.jpeg)◊
 >   ◊ Sephadex G系列
 >   ◊
 >   
 >   ◊ Superdex系列
 >   ◊
 >   ◊
 >   ◊
 >   ◊
 >   ◊ Superose系列
 >   ◊
 >   ![](media/c8885af27d18bc5f8d8c389d1446aaa8.jpeg)◊ Sepharose系列
 >   ◊
 >   ◊
 >   ◊
 >   ◊ 1
 >   ◊ Sephacryl系列
 >   ◊
 >   ◊
 >   ◊
 -   层析柱的使用
    ◊ 凝胶过滤层析柱的运行参数及填料数据
    ◊ 可找供应商要
    ◊ 凝胶过滤层析柱的装填
    ◊ 两部流速填装（不要超压）
 >   ![](media/f3f6c584c5d8dd44e6fabb59232398c0.jpeg)
 -   层析柱的反向清洗
    ![](media/ca29b3cf56965d557d7e71b3ed654f40.jpeg)◊
    多次使用后填料会变脏，反压会变大
 >   ◊
 >   ◊ 一般10次\~20次进行一次反向清洗（柱子下端较上端洁净）
 -   ![](media/b74a33f5cf6531e77093a84b191e280c.jpeg)层析柱的保存
 >   ◊
 >   ◊ 1
 -   层析柱滤膜的更换
    ◊ 如果在清洗后层析柱依然很脏、反压很大则可以更换上端的滤膜
 >   ![](media/00c0151810bcc7f051d93b745b5573f0.jpeg)◊
--- a/层析原理/层析分类.md
+++ b/层析原理/层析分类.md
@ -0,0 +1,27 @@
 * 非吸附层析
 * 吸附层析
    * 离子交换层析
    * 疏水作用层析
    * 亲和层析
 * 复合层析
 -   层析技术的分类
    -   图片
 >   ![](media/8e4726c25ece65142b13c643d0be5d7a.jpeg)□
 -   液相层析类型的选择
 | 生物分子特性               | 层析类型             |
 |----------------------------|----------------------|
 | 尺寸和形状                 | 分子筛               |
 | 电荷                       | 离子交换层析         |
 | 亲和性                     | 亲和层析             |
 | 疏水性                     | 疏水作用层析反相层析 |
 | 电荷和疏水性正电荷和负电荷 | 混合模式层析         |
--- a/层析原理/层析分辨率.md
+++ b/层析原理/层析分辨率.md
@ -0,0 +1,33 @@
 分辨率/分离系数（Rs：Resolution）
    -   表彰两个峰的分离度，出峰差和峰宽进行比较，Rs=1表明2个峰刚好分离，可节约时间，Rs＜1分离度不行
 -   ![[层析分辨率.jpg]]
 -   分辨率优化的两个方向
    -   选择性（分辨率分子）
        -   填料配基的选择
        -   目标分子和吸附配基的结合条件优化（结合液性质）
        -   分离条件优化（洗脱液性质和洗脱梯度）
        -   ![](media/8ac625320d42c79af6d9460116f76d40.jpeg)图片
 ![](media/fa5b97ed3ddfa1f698b35aefb1939bf9.jpeg)
 -   有效性（分辨率的分母）
    -   填料基架颗粒直径的选择（颗粒直径越小峰越尖）
        -   良好的柱填装技术（层析柱的柱效）
        -   目标分子的体积大小，溶液的粘度
        -   运行的流速
        -   ![](media/2f8c600128e09249491e557e8b90f78c.jpeg)图片
--- a/层析原理/层析压力.md
+++ b/层析原理/层析压力.md
@ -0,0 +1,3 @@
 -   压力
    -   跟颗粒直径有很大的关系，小颗粒反压大，柱高高反压大
--- a/层析原理/层析填料.md
+++ b/层析原理/层析填料.md
@ -0,0 +1,5 @@
 -   层析介质表征
 -   ![](media/6fc1606c2b38662aeaacc0251303f821.jpeg)图片
 >   
--- a/层析原理/层析填料粒径.md
+++ b/层析原理/层析填料粒径.md
@ -0,0 +1,3 @@
 -   平均粒径（dp）
    -   介质的平均粒径（average bead diameter）
--- a/层析原理/层析填料载量.md
+++ b/层析原理/层析填料载量.md
@ -0,0 +1,37 @@
 载量（吸附层析）
    -   单位体积填料吸附的样品量
    -   影响因素
        -   样品性质：分子量、形状、带电性、疏水性、标签暴露
        -   填料性质：配基类型和配基密度
        -   操作条件：pH、盐浓度、添加剂、样品浓度、温度、流速
    -   ![](media/15b7e65fc950f6115f40a2caa3041053.jpeg)图片
 >   □
 -   载量的测定（可同时进行缓冲液优化）
    -   静态载量测定
        -   一般研发阶段进行测定
            -   可进行缓冲液优化
            -   ![](media/4cd76f7545b26ede575a1632ad34fdb1.jpeg)图片
 >   ◊
 -   动态载量测定
    -   一般生产规模进行测定
        -   根据动态载量来选择柱床体积
            -   ![](media/85559fa568c19430fbd07e7b4c26554b.jpeg)图片
 >   ◊
--- a/层析原理/层析技术的发展.md
+++ b/层析原理/层析技术的发展.md
@ -0,0 +1,5 @@
 * 分子筛→在分子筛基础上介质基质+基团，形成吸附类层析
 * 有分子筛效应和交换效应
 * 大分子效应？？？
--- a/层析原理/层析技术的发明.md
+++ b/层析原理/层析技术的发明.md
@ -0,0 +1,16 @@
 -   层析技术的发明
    -   1906年植物色素分离：碳酸钙吸附剂/石油醚
    -   固定相吸附剂：碳酸钙
    -   流动相：石油醚
    -   样品：植物色素分子
    -   操作方式：重力流动
    -   分离原理：植物色素分子具有性质差异，使得每种色素在层析柱中的迁移速率不同
    -  ![[层析起源.jpg]]
--- a/层析原理/层析术语.md
+++ b/层析原理/层析术语.md
@ -0,0 +1,25 @@
 * 层析相关体积
 * 辨率/分离系数
    * 选择性
    * 有效性
 * 平均粒径
 * 柱床高度
 * 压力
 * 柱效
 * 理论塔板数
 * 线性流速和体积流速
    * 线性流速
    * 体积流速
 * 载量（吸附层析）
--- a/层析原理/层析柱床高度.md
+++ b/层析原理/层析柱床高度.md
@ -0,0 +1,3 @@
 -   柱床高度（L）
    -   层析柱装填好之后介质的高度，单位为cm
--- a/层析原理/层析柱效.md
+++ b/层析原理/层析柱效.md
@ -0,0 +1,65 @@
 -   柱效（反应柱子装填效果，柱效不行的时候就该考虑重新装柱了！！！）
    -   柱效组成和评判标准
 -   理论塔板数（N）
    -   跟装柱高度有关，柱高越高，理论塔板数越高
        -   N=5.54（Ve/Wh）2
            ◊ Ve：洗脱体积，峰尖对应的体积
            ◊ Wh：半峰高的宽度
        -   每米理论踏板数（Nh）
            -   Nh=N/L
                ◊ N：理论塔板数
                ◊ L：柱床高度，cm
        -   理论塔板高度（HETP）
            -   跟填料颗粒大小有关，大颗粒的理论塔板高度大，一般在3\~5倍颗粒直径比较好
            -   HETP=L/N
        -   不对称因子（As）
            -   1/10峰高左右两边宽度的比值，0.8\~1.2最好
            -   As=1：峰最好的形状
            -   As＞1：峰拖尾，
            -   As＜1：峰前倾，
        -   图片
 >   
 >   
 -   测柱效方法
    -   走样品
        □ 流速：15\~30cm/h
        -   1%丙酮（紫外280nm检测）或2M NaCl（电导检测）
            □ 上样体积：0.5%\~2%
    -   柱效测定常见的问题、原因和措施
 | 问题                                                 | 原因                                        | 措施                                                  |
 |------------------------------------------------------|---------------------------------------------|-------------------------------------------------------|
 | 峰前倾                                               | 柱床过紧                                    | 重装柱子或降低装柱流速                                |
 | 峰拖尾                                               | 柱床过松                                    | 重装柱子或增加装柱流速                                |
 | 双峰，主峰前有“额外峰”，柱床上裂缝                   | 泵脉动，产生空气 柱床过紧                   | 使用其他类型的泵或增加空气陷阱 重装柱子或降低装柱流速 |
 | 双峰，主峰后有“额外峰”，柱床上或介质与入口之间有裂缝 | 柱床过松                                    | 重装柱子或调整柱头，增加装柱流速                      |
 | 不对成因素增加（拖尾增加，前伸减少）                 | 柱床过松，介质与入口有空气 柱子没有适当平衡 | 重装柱子或增加装柱流速 重新平衡柱子，重新测试         |
 | 不对成因素增加（前伸增加，拖尾减少）                 | 柱床过紧，有裂缝且越加严重柱子没有适当平衡  | 重装柱子或降低装柱流速重新平衡柱子，重新测试          |
 | 板数量减少                                           | 柱床过紧或过松                              | 重新装柱                                              |
--- a/层析原理/层析相关体积.md
+++ b/层析原理/层析相关体积.md
@ -0,0 +1,13 @@
    -   Vo：外水体积/空流体积，填料分子外的体积，根据几何学原理，体积大约占柱体积的1/3，精确测量使用2000KD的葡聚糖
    -   Vi：内孔体积/内水体积，填料分子内的体积，
    -   Vt：总液体体积
    -   Vs：固相凝胶体积，大约占柱体积的5%
    -   Vc:柱体积，根据柱高和直径计算得到，又称柱床体积
    -   Ve：保留体积/洗脱体积，又叫VR
    -   体积压缩比：
--- a/层析原理/层析系统构成.md
+++ b/层析原理/层析系统构成.md
@ -0,0 +1,15 @@
 * 层析柱构成
 * 柱体
 * 层析介质
 * 压头
 * 筛板
 * 密封圈
 * 空气陷阱
--- a/层析原理/层析线性流速和体积流速.md
+++ b/层析原理/层析线性流速和体积流速.md
@ -0,0 +1,11 @@
 -   线性流速和体积流速
    -   线性流速（cm/h）
        -   液体前沿沿柱管单位时间向下的迁移距离
        -   线性流速可用于不同层析柱之间比较
    -   体积流速（ml/min）
        -   体积流速=线性流速（cm/h）× π ×r2（cm2）÷60（min/h）
--- a/层析原理/层析色谱原理.md
+++ b/层析原理/层析色谱原理.md
--- a/层析原理/疏水作用层析.md
+++ b/层析原理/疏水作用层析.md
@ -0,0 +1,219 @@
 >   疏水作用层析
 >   2021年6月24日 21:49
 -   疏水相互作用层析（盐析原理）
    -   基本原理
        ◊ 基本定义
        ◊
        根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白质和层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离物质
        ◊ 高盐上样，低盐洗脱
        ◊ 熵增驱动
        ◊ 反向层析
        ◊
        蛋白与反相介质表面更强的疏水作用导致更强的蛋白保留，因而通过与水混溶的有机修饰剂如乙腈、乙醇、甲醇或异丙醇洗脱蛋白
        ◊ 蛋白质的疏水性
        ![](media/c05e6fff9d6bde454cd377aa0197c2cd.jpeg)◊
        氨基酸是蛋白质的基本组成单位，不同的氨基酸具有不同的疏水性侧链
 >   
 >   ◊
 >   理论上，蛋白质疏水性的侧链被包裹在蛋白质内部，但是由于周围热力学稳定的要求，蛋白质的结果会随所处的环境变化而变化，因此有部分疏水侧链
 >   暴露在蛋白质表面，形成疏水区域
 >   ◊ 影响蛋白质疏水的因素有：离子强度、pH、温度、溶剂种类
 >   ![](media/286b84ff367c2ab9c835833f74dfbaed.jpeg)◊
 >   蛋白质表面既有疏水性区域也有亲水性区域
 
 >   ◊ 水分子的极性和作用
 >   ![](media/875e7d41c5907d2f52cac92445f80722.jpeg)◊ 水是一种极性分子
 
 >   ◊ 亲水作用和疏水作用
 ![](media/b35fed0261f6a6cea75649c40dbfaf47.jpeg)
 >   ◊ 盐的添加与可逆相互作用
 >   ![](media/5be320f693b0f89ca357d13ffda21986.jpeg)◊
 >   疏水性的平衡主要由盐控制（高盐结合、低盐分离）
 
 >   ![](media/8747b235bc33cc368edec5181eca5927.jpeg)◊
 >   由分离到结合是一个熵增的过程（无需水分子增加，自发的过程）
 
 -   层析步骤
    ◊ 高盐上样，低盐洗脱
 >   ![](media/ba6929689ecb49c30cfaf9f810e19762.jpeg)◊
 -   条件优化（影响因素）
    ![](media/a4d512a51ce0e3fd033aa28a93e6bca9.jpeg)◊ 层析设备的选择
 >   ◊
 >   ◊ 缓冲液的选择
 >   ![](media/e0175aa303568f4042c5cd6f6f1fb9bc.jpeg)◊ 溶质种类
 
 >   ◊ 合适的离子强度
 >    离子强度决定样品的吸附或者流穿
 >   ![](media/7c287e8bd6105662f246575670de306a.jpeg)
 >   不同的离子强度表现出不同的选择性
 –
 >   ◊ 初次试验条件推荐
 >    结合缓冲液：50mM PBS pH7.0，含有1\~1.5M硫酸铵
 >    洗脱缓冲液：50mM PBS pH7.0
 >   ◊ 合适的添加剂
 >    提高疏水相互作用层析分离的添加剂
 >   ![](media/57e8291b724a91c1d5df700b67b11506.jpeg)
 >   含有添加剂的缓冲液进行空白梯度洗脱，检查他们对洗脱图谱的影响
 –
 >   ◊ 层析填料的选择
 >   ![](media/de48ea475a52a04c358c6ff1052ba68b.jpeg)◊ 基架的选择
 >   
 >   ◊ 不同样品具有不同的疏水性（不可预测）
 ![](media/eb27c9dc95fffe23884d3890d9f1dfce.jpeg)
 >   ![](media/882a4c0fc50b7b765adc36aefc6dc969.jpeg)◊ 配基类型
 
 >   ![](media/90fc9bd82ef07dfbdfb3c2c470b6462a.jpeg)◊ 配基密度（配基偶联密度）
 
 >   ◊ 快速筛选填料
 >   
 >   
 >   ◊ 样品的准备
 >   ◊ 样品最好溶解到起始缓冲液中
 >   ◊ 可以直接向样品中加盐，提高电导率
 >   ◊ 小体积可使用脱盐柱上进行缓冲液置换
 >   ◊ 过滤和离心来去除不溶物，防止堵塞层析柱
 >   ◊ 洗脱方式的选择（类离子交换）
 >   ![](media/3316b8c278504edd5f5934521eb2717b.jpeg)◊ 梯度洗脱
 
 ![](media/c0c1e65be07dca7c8359b2c4322b304c.jpeg)
 >   ![](media/9bf32b0a2ae18ca34cea945eeb4a1256.jpeg)◊ 步级洗脱
 
 >   ◊
 >   ◊ 填料的清洗和再生
 >   ![](media/775d1d0008ef666c35342cf3ef7b0130.jpeg)◊ 再 生
 
 >   ![](media/919f5d9e1f5ef56af6c7f95ecc87a8f2.jpeg)◊ CIP
 
 >   ![](media/a4d1e72bdca2eb84fdd8e8d6748a89b9.jpeg)◊ 保 存
 
 >   ◊ 影响试验的其他因素
 >   ◊ 温度影响（尽量在室温下进行）
 >   ![](media/c800800e0a3a4f4c0089fc4dfa79dfca.jpeg)
 >   ![](media/4eaaa91dbcd5405fd3a390e791020e69.jpeg)◊ 流速影响（流速慢分辨率高）
 >   
 >   ◊ 其他情况分析
 >    目的蛋白在梯度里很早洗脱，分辨率差
 -   高盐浓度起始环境下，重复进行分离
 -   使用由更强盐析作用的盐
 -   更换配基
     目的蛋白在梯度末端洗脱，分辨率差
 -   低一些盐浓度的起始缓冲液条件
 -   弱一些盐析作用的盐
 -   更换配基
     目的蛋白在梯度中间洗脱，分辨率差
 -   分段梯度，在目的蛋白用更缓的梯度进行
 -   使用添加剂提高分辨率
 -   后续使用其他层析技术分离
    ![](media/5852ee494f7ec398d2a408d50d5a7dab.jpeg) 图 片
 >   –
 -   疏水层析在纯化工艺中的位置
    ◊ 盐析和变复性，高盐除核酸之后
    ◊ 离子交换交替使用
 >   ![](media/7d334e47669c9a55c0b31fe29e7686ca.jpeg)
 -   ![](media/eb4d90205a49550ab379fbbfadcafa6f.jpeg)应用举例
 >   ◊
 >   ◊ 1
--- a/层析原理/离子交换层析.md
+++ b/层析原理/离子交换层析.md
@ -0,0 +1,182 @@
 >   离子交换层析
 >   2021年6月24日 21:49
 -   离子交换层析
    -   基本原理
        ◊ 基本定义
        ◊ 通过生物分子所带的电荷与填料上所带的相反电荷的可逆互作用来分离物质
        ◊
        盐离子可以与生物分子（蛋白质）竞争性结合带电配基，可通过提高离子强度洗脱蛋白质
        ![](media/769ca09bfa81530fd323d482b9de988a.jpeg)◊ 蛋白质的表面净电荷
 >   ◊
 >   ◊ 蛋白质的滴定曲线与等电点
 >   ◊
 >   ◊
 >   ◊ 优 势
 >   ◊ 领域宽：任何带电生物分子（蛋白、多肽、核酸、多糖）
 >   ◊ 高分辨率：差距仅在一个氨基酸
 >   ◊ 高载量：20\~100mg/ml填料，生产需自己测定
 >   ◊ 最常用：75%工艺中使用
 >   ◊ 可控性好
 >   ◊ 高收率
 >   ◊ 浓缩效应
 >   ◊ 难 点
 >   ◊ 寻找最佳实验条件，优化结果
 -   层析步骤
    ![](media/20cdb16a76e01ba60667b8ff76f792f0.jpeg)◊ 低盐上样，高盐洗脱
 >   ◊
 -   影响因素（条件优化）
    ![](media/3f20b2784d98d237c01792acffe844a5.jpeg)◊ 层析设备的选择
 >   ◊
 >   ◊ 缓冲液的选择
 >   ◊ 确定目标蛋白等电点
 >   ![](media/2959036a1a4892dd1d5730d4bdd959a4.jpeg)
 >   ◊ 确定pH值（关键影响因素）
 >   
 >   
 >   ◊ 缓冲体系的确定
 >   ![](media/b4b89ee3ffed180c1a48b37bceedca2e.jpeg)
 >   ![](media/a966b36e09bb4ce9833150b8c35f17ab.jpeg)◊ 缓冲液pH的影响因素
 >   
 >   ![](media/d5c21e8991f153a18510e73673d14f1f.jpeg)◊ 添加剂的选择及潜在问题
 >   
 >   ◊ 层析填料的选择
 >   ◊ 离子交换填料的组成
 >    基架+配基
 >   ![](media/8596a0f9e0ea4727e733228079eaebca.jpeg)–
 >    基架的材料-天然材料
 >   –
 >   –
 >   –
 >   –
 >   ![](media/cab000728fd5f77478c562a7df8569fe.jpeg) 基架的材料-合成材料
 >   –
 >    基架的粒径大小
 >   –
 >   –
 >    配基的类型
 -   ![](media/465118a2ad8ffe12041fba402f0e6bb6.jpeg)阴离子交换剂
 
 -   ![](media/c1bda630783a579f80c87d6dce26fdfd.jpeg)阳离子交换剂
 
 -   根据蛋白质的等电点和稳定性来选择离子交换填料的类型
 -   如果目标蛋白的等电点低于pH7.0或未知，用强阴离子交换剂进行初次试验
 >   ![](media/9182e4f65d9fbace63d468d66e8ff2d5.jpeg)
 >   ![](media/51908cd1faa221a8a5d029f7fdff199a.jpeg) 配基的强弱
 –
 >   ![](media/f4f138207d6f657c3f1cdc010dba6f7c.jpeg)◊ 快速筛选填料
 >   
 >   
 >   
 >   ![](media/1248376a22ad37baccc9a6d4cfc53268.jpeg)◊ 科研用户推荐
 
 >   ◊ 工艺开发客户
 ![](media/130ca96d13dee079027490dec7a2d8f0.jpeg)
 >   ![](media/3a6a64cb98d812a8526a75a2ac413223.jpeg)◊ 样品的准备
 >   ◊
 >   ◊ 洗脱方式的选择
 >   ![](media/e474e92fa1a18d43d2714b6baa4ef433.jpeg)◊ 梯度线性洗脱
 
 ![](media/39637631b6fd07a73d68a43d7dfef832.jpeg)
 >   ![](media/a785b7eee7c252d9eb98b4f464a4e335.jpeg)◊ 步级洗脱
 
 >   ◊ 填料的清洗和再生
 >   ![](media/39dd619f8adb1855ceab80cfff910683.jpeg)◊ 再 生
 
 >   ![](media/7dbb83d518a982f435d86a3e7916952c.jpeg)◊ CIP
 
 >   ◊ 保 存
 >   ![](media/95ae7228b1811bd0d79fc785433aae5d.jpeg)
 -   应用举例
 >   ◊
 >   ◊
 >   ![](media/2756d29d05d5784ccdcb1c83d2ddaadb.jpeg)◊
--- a/柱效测定.md
+++ b/柱效测定.md
@ -0,0 +1,196 @@
 # 前言
    在目前的生物制药行业，绝大多数的分离纯化，都会应用到层析技术，当然目前化药、中药提取、化妆品、甚至食品行业也会应用到层析技术。涉及到层析技术就涉及硬件设备装填介质后应用于生产，但可用于生产的前提或者说是标准，需要一个衡量指标来衡量装柱效果，这个衡量标准就是我们本文要提到的“柱效”，当然不止柱效一个参数，还包括对称性，拖尾因子等。这些参数都将在测量柱效时一同处理。
    理论塔板数N，色谱的柱效参数之一,（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
    测量柱效需尽量满足理论条件，才可更接近实际值。
 # 柱效测定的理论基础
 柱效的计算公式：
 理论塔板数N=5.54×(t/W1/2)2
 对称性Af=b/a
 其中：
    N:   当前柱高的理论塔板数
    t： 保留时间
    W1/2 :   半峰宽
    A~f~ ：对称性
    a:   延时间轴正向10%峰高处至100%峰高处时间
    b：延时间轴正向100%峰高处至10%峰高处时间
   备注：通常有时还会有拖尾因子，实际生产时用的不多，对于一些检验用的层析柱会要求拖尾因子在1-1.05，拖尾因子的计算方式是5%峰高处的a和b的比值。
    当峰型符合正态分布时，采用该计算方式。
 ![](image/柱效测定/1651727584909.png)
    理论塔板数：根据填料颗粒粒径大小计算，在当前柱高的理论高度中，竖向堆积填料颗粒的理论数量。
    实际计算柱效为理论塔板数的1/2-1/3左右，没有特殊说明默认为1米条件下。
    例如：DEAE 90um填料的理论塔板数应为
    1m/90um=11111.11
    11111.11×（1/2-1/3）=5555-3700
    所以实际柱效的理论值在3700-5555左右，实际值还会偏低一般在3000-5000左右，有时甚至更低。
    备注：通常DEAE用于生产时，并不看重柱效，实际2000左右时也会用于生产，除非是柱效对生产的结果影响较大时，会考虑柱效，并且高柱效并不是每次都可装填出，设定标准是不建议定过高，避免影响生产。
    柱效：从名字上理解是层析柱的分离效果。层析柱柱的有效塔板数越大或有效的塔板高度越低，色谱柱的柱效越好，类似于每个塔板的分离效率相同，有效塔板数越多，最终得到的物质越纯。柱效率是指溶质通过色谱柱之后其区域宽度增加了多少，它与溶质在两相中的扩散及传质情况有关，这是所谓色谱的动力学过程。根据塔板理论，可以计算一根色谱柱所达到的理论塔板数，或表达为每米理论塔板数n/m。显然，N值越大，或H值越小，柱效越高。分散效果主要取决于所选择的固定相。
 # 测量柱效的方法
 ## 前期准备
    准备好测试溶剂及测试样品
    具备紫外检测器或电导率检测器的层析系统
    样品至进入柱内及从流动相出口至检测器管路越短越好
 ## **配置溶液**
    目前绝大多数的测量样品溶液，通常选用1%柱体积（以下简称CV）上样量，1%的浓度（当柱直径大于1000mm以上时包括1000mm可考虑2%的浓度，减少因管路过大而对样品产生的稀释）。
    样品溶液及流动相溶液的选择通常选用条件为：
    填料耐受
    设备耐受
    填料不吸附
    无作用力或作用力最小
    黏度低
 填料耐受：所使用溶液不会破坏填料的结构及框架，否则高附加值的填料将浪费。
 设备耐受：所使用溶液同样需被硬件设备耐受，以免破坏设备及影响测量结果。
 填料不吸附：使用溶液如含有填料可吸附物质，将影响柱效，所测量值偏离正常结果，或无法洗脱。
 无作用力或作用力小：尽量选择和填料间无作用力或作用力低的溶液，减少影响因素，追求接近理论值。
 粘度低：黏度高的溶液会使运行时压力过大，并且可能造成拖尾现象。
 ## 下面列出目前通用的，主流的柱效测试溶液选择：
 ### A.低压填料（绝大多数软胶，耐受3bar压力）
 ![](image/柱效测定/1651727767545.png)
    90μm粒径DEAE                     						34μm粒径S100
 通常有两种方式：
 #### 丙酮法：
 用纯化水做流动相平衡2CV以上，并且紫外检测器波长调制254nm或280nm，并且平衡时基线稳定，1%丙酮做样品做测试。
 #### NaCl法：
 以0.4MNaCl平衡2CV以上，并且电导率曲线趋于平稳，最好柱前与柱后都有电导率检测器，前后一致及稳定后，2MNaCl上样，测量柱效相对最好，但由于层析设备及层析柱绝大多数的不锈钢材质都为316L，而316L不锈钢对氯离子耐受能力为在2MNaCl下，25℃，可耐受1小时，处于耐受问题可选择0.8MNaCl上样或1.0MNaCl上样。此方法较丙酮法的优点为NaCl更环保，不考虑有机溶剂处理及残留的问题。缺点为必须平衡稳定后才可测量柱效，否则峰形不稳定。此方法测量的柱效/对称性较丙酮偏低，物料损耗大。
 ### B.  高压填料（基本为反相填料）
 上文说到的填料不耐受在此处有体现，大多数反相填料，无法耐受纯水相，纯水相会导致填料功能基团失效。
 #### 萘-乙腈法
 用100%乙腈做流动相平衡2CV以上，并且紫外在254nm处基线稳定，1%萘-乙腈溶液做样品测试。
 #### 甲苯-乙腈法
 用50%乙腈-水溶液做流动相平衡2CV以上，并且紫外在254nm处基线稳定，1%甲苯50%乙腈-水溶液做样品测试。
 ### C.其他
 由于市面上的填料厂家过多，A与B中目前为主流测试方法，其他需根据填料生产厂家提供的测试方法 。
 # 柱效结果分析
 ## 峰型
 ![](image/柱效测定/1651728095091.png)
 ### 标准峰
 符合正态分布可正常计算柱效，大多数峰均可计算柱效查看装柱状态是否良好，但双峰或者多峰就无计算的必要，需查找原因重新测定或者重新装柱。
 ### 骆驼峰
 当前样品出现两次峰型，主要原因一般为填料在层析柱内部断层，不均一，一般是由于装柱时进气，或者二次压柱导致填料出现断层。另一原因主要为填料过脏（主要为上层）或者柱头有堵塞的情况。出现以上情况都需处理后，重新装柱
 ### 拖尾峰与前倾峰
 当A~f~＞1时，我们称作拖尾，拖尾为柱床压的过松，当A~f~＜1时我们称作前倾，前倾为柱床压的过紧。通常在0.9-1.3的范围内我们认为良好对称性，对于部分要去不高的甚至卡到0.8-1.5，就可满足生产（因有时为第一步粗纯，较好的对称性的柱效有时效果不明显（主要还是考虑到实际生产的便捷性），但总体上的效果还是柱效越高，对称性越接近于1，效果越好。
 ### 矮胖峰
 通常的主要原因为样品进入柱子时被稀释，选择柱子进口上样，如还存在问题，需重新装柱，再次测量柱效。
 ### 毛刺峰
 通常的主要原因为有细小气泡伴随样品出现，排气泡后再次测量，如效果不达标，需重新装柱，装柱过程中注意提前排气泡，对填料进行更好的匀浆，将填料内部气泡尽量排出。
 ### 漂移峰
 通常的主要原因为为平衡好，基线不稳，重新平衡，平衡稳定后，再次测量柱效，结果不合格时重新装柱。
 ### 阶梯峰
 通常的主要原因为有残留死体积大导致，可能是由于密封圈使用错误导致，检查密封圈使用的是否正确，并检查是否有加大死体积部位，后重新测量，如结果不合格需重新装柱。
 ## 出图分析
 ### 柱效
 柱效已经在上文中提过，计算方式基本通用于99%以上的填料，此方法计算的为大概数据，通常柱效会比计算值偏低，主要是由于填料粒径的均一度，还有功能基团的大小所影响，导致实际测量效果会更低。
 根据笔者的经验之谈，大多数DEAE柱效在3000左右时，就可以满足生产，但也有药品的生产需求高柱效。
 ### 对称性
 通常填料供应商给出的对称性很宽泛，一般在0.8-1.8均认为合格，在早期的生产中，绝大多数也认为可行，但随着行业发展目前对对称性的要求越来越高，以目前的状况来看对称性在0.9-1.3之间，在生产上普遍认为可接受，在个别生产中要求在1.2以内，甚至1.1左右，这是对于生产来说，对于检验用的预装色谱柱会要求在1.0左右，并且要求拖尾因子在1.0-1.05。
 还有一点比较重要，就是不同供应商设备测量的柱效不一致，据笔者了解，差异很大，如实际用时，可采用手动作图来验证数据差异。
 另外，装柱时的压力，流速，匀浆比，压缩比需确定，这几项参数对装柱结果影响巨大，同时这些参数也需要根据填料的具体使用状况做细微的变动。如填料使用多次后，有时需加大压缩比来保证对称性。
 # 柱效测定实例
 ## 测试使用设备
 ![](image/柱效测定/1651728251562.png)
 ## 不同溶液测试的图谱
 ![](image/柱效测定/1651728643378.png)
    丙酮法测量90um填料柱效       				NaCl法测试90um填料柱效
 备注：两者不是同一次装柱测量
 图中的两次为东富龙海崴的层析系统及层析柱实际装柱测量的柱效，层析系统为20L/min流速的梯度层析系统，层析柱为ID 600mm x 600mm自动低压层析柱，两图的测量结果均满足可实际生产的标准。
--- a/海济工艺/DEAE1.md
+++ b/海济工艺/DEAE1.md
@ -0,0 +1,85 @@
 0.04M NaCl：结合能力减弱，杂质流穿
 0.1M NaCl：目的蛋白
 M NaCl：洗脱结合杂蛋白
 > DEAE1
 > 2021年6月24日 21:48
 - DEAE1
 - 目的
 □
 > 捕获目的蛋白
 - 层析原理
  - 离子交换（弱阴离子交换），低盐上样，高盐洗脱
 - 层析柱型号
  柱内直径（cm）
  柱高（cm）
  柱床体积（L）
  柱床高度（cm）
  上样量mg/ml
  蛋白处理范围（g）
  INDEX 200/500
  20
  50
  8.5±0.5
  25±5
  25\~50
  200\~450
 > ○
 - 填料信息
  - 名称：DEAE Sephrose F.F
  - 更换时间
 
 - 柱效要求
  2014年
 - 每米理论塔板数：≥2000
  □ 对称性：0.8\~1.2
 - 缓冲液
  - 平衡缓冲液
    - 0.3mol/L Tris-HCl-30m mol/L EDTA
    - 0.04mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
  - 样品调节缓冲液
    - 0.04mol/L NaCl -10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
  - 冲洗缓冲液
    - 0.04mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
  - 洗脱缓冲液
    - 0.1mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
 - Q&A
 - 装柱比较困难
 > 分区 层析 的第 1 页
--- a/海济工艺/DEAE2.md
+++ b/海济工艺/DEAE2.md
@ -0,0 +1,95 @@
 >   DEAE2
 >   2021年6月24日 21:49
 -   DEAE2
 -   目的
 □
 >   捕获目的蛋白
 -   层析原理
    -   离子交换（弱阴离子交换）
    -   层析柱型号
        柱内直径（cm）
        柱床体积（L）
        柱床高度（cm）
        上样量mg/ml
        蛋白处理范围（g）
        INDEX 100/500
        10
        3.0±0.5
        40±5
        15\~40
        37.5\~140
        INDEX 140/500
        14
        5.5±0.5
        35±5
        15\~40
        75\~200
 >   ○
 -   填料信息
    -   名称：DEAE Sephrose F.F
        -   更换日期
 
 -   柱效要求
    2014年
 -   每米理论塔板数：≥2000
    □ 对称性：0.8\~1.2
 -   缓冲液
    -   平衡缓冲液
        -   200m mol/L PB
            -   5m mol/L PB
        -   样品调节缓冲液
            -   5m mol/L PB
        -   冲洗缓冲液
            -   5m mol/L PB
        -   洗脱缓冲液
            -   0.02mol/L NaCl-5m mol/L PB
            -   0.05mol/L NaCl-5m mol/L PB
            -   0.08mol/L NaCl-5m mol/L PB
 >   分区 层析 的第 1 页
--- a/海济工艺/G25.md
+++ b/海济工艺/G25.md
@ -0,0 +1,89 @@
 胶不能碎
 > G25
 > 2021年6月24日 21:48
 - G25
 
 > 目的
 - 将样品中的盐脱去，降低离子强度，为下一步DEAE1层析做准备
 - 层析原理
  □ 分子筛，全排阻
  - 层析柱型号
    柱内直径（cm）
    柱高度（cm）
    柱床体积（L）
    柱床高度（cm）
    上样量
    蛋白处理范围
    INDEX 200/950
    20
    95
    25.0±0.5
    80±5
    ≤25%柱床体积
    ≤6.125L
 > ○
 - 填料信息
  - 名称：SephadexG25 Medium
    - 更换时间
 
 
 - 柱效要求
  2014年
 > □ 每米理论塔板数：≥2000
 > □ 对称性：0.8\~1.2
 - 缓冲液
 - 平衡缓冲液、洗脱缓冲液
  - 10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH 8.0±0.2
    - 最终蛋白质缓冲体系
      □ 1
 - 装柱
 - Q&A
 - G25下样液电导率≤1.5
  - 上游超滤有问题，重现装柱
 - 柱头膜可能有问题
  - 现在在反向上样
 - G-25最高收率为何能到98%，下样液电导率最高到多少能够接收？
 - G-25怎样才能加快流速增加效率
 > 分区 层析 的第 1 页
--- a/海济工艺/Phenyl.md
+++ b/海济工艺/Phenyl.md
@ -0,0 +1,122 @@
 基质为疏水
 样品处理原理为盐析，破环水化膜，暴露疏水核，才能与疏水介质进行结合
 经验：定量蛋白，不断加硫酸铵，直至要盐析的状态：泛白，搅拌溶解
 洗脱：第1个峰：分离峰，冲杂蛋白，冲洗体积大
 0.35峰：过渡峰，部分收集
 0.05峰：收集峰、富集峰，目的蛋白的主要收集
 >
 >
 > Phenyl
 - 目的
 □
 > 捕获目的蛋白，除去宿主蛋白（相关蛋白质）
 - 层析原理
  □ 疏水作用，盐析作用，通过控制离子强度，高盐上样，低盐洗脱
  - 层析柱型号
    柱内直径（cm）
    柱高（cm）
    柱床体积（L）
    柱床高度（cm）
    上样量mg/ml
    蛋白处理范围（g）
    INDEX 140/500
    14
    50
    5.5±0.5
    35±5
    20\~35
    100\~210
 > ○
 - 填料信息
  - 名称：Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（high sub）
    - 更换时间
 
 
 - 柱效要求
  2014年
  2021.07
 > □ 每米理论塔板数：≥2000
 > □ 对称性：0.8\~1.2
 - 缓冲液
 - 平衡缓冲液
  - 0.7mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
 - 样品调节缓冲液
  - 3.5mol/L (NH4)2SO4溶液、1mol/L Tris-HCl-100mmol/L EDTA
 - 冲洗缓冲液
  - 0.7mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
 - 洗脱液
 - 备注
 - 0.5mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
 - 0.35mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
 - 0.05mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
 - 能较好反应前端工序情况
  - 收集峰形可能变化较大
 - Q&A
 
 
 
 
 
 
 Phenyl工序对上样液调样时，不考虑里边有0.1mol/L氯化钠，直接规定了硫酸铵浓度为0.7mol/L，而不是规定一个电导率范围
 Phenyl工序调样容易产生絮状物，容易堵柱子和增大反压，手法应该怎么改进，减少絮状物的产生
 Phenyl工序上样后阶段性出现多次柱头接触的胶出现裂缝的现象，但为什么对其收率及相关蛋白质影响不是很大调样后上样液的电导率要求是11.5±0.5mS/cm，是否与平衡液电导率一致或者高一点吸附效果更好
 如果上样过程中出现干柱现象，应该怎么处理
 Phenyl工序使用不同浓度的硫酸铵洗脱蛋白，目的蛋白在0.35\~0.05mol/L之间洗脱，分别为3、4、5\#样，为什么不直接使用
 0.05mol/L的直接洗脱收集3、4、5\#样
 > 分区 层析 的第 1 页
--- a/海济工艺/S-100.md
+++ b/海济工艺/S-100.md
@ -0,0 +1,130 @@
 非全排阻
 大分子难进，难深入
 除二聚体、四聚体
 比全排阻更注重介质完整性
 > S-100
 > 2021年6月24日 21:49
 - 盐析（去除硫酸铵、Tris，缩小体积，将缓冲体系更换为PB）
 - 盐析
 □
 □
 □
 □
 > 目的：使蛋白沉淀出来温度：？
 > 硫酸铵用量：3.5mol/L硫酸铵溶液→硫酸铵终浓度：1.35mol/L～1.83mol/L
 > 时长：10min
 - 一次离心
  - 目的：使蛋白沉淀与杂质溶液分离
    □ 温度：4℃
    □ 离心力：9910g
    - 时长：30min
    - 留存：蛋白沉淀
  - 蛋白溶解
    - 目的：使蛋白沉淀溶解
    - 溶解液：5m mol/L PB pH 7.2±0.1
    - 蛋白浓度：35mg/ml\~50mg/ml
  - 二次离心
 □
 □
 □
 □
 □
 - S-100
  - 目的
 □
 > 目的：使目的蛋白溶液与杂质蛋白沉淀分离
 > 温度：4℃
 > 离心力：9910g 时 长 ：15min 留存：上清液
 > 除去高分子蛋白质
 - 层析原理
  - 分子筛，非全排阻，每米理论塔板数很重要
  - 层析柱型号
    柱内直径（cm）
    柱高度（cm）
    柱床体积（L）
    柱床高度（cm）
    上样量
    蛋白处理范围
    BPG 200/950
    20
    95
    25.0±0.5
    80±5
    ≤6%柱床体积
    ≤1.47L
 > ○
 - 填料信息
  - 名称：Sephacryl S100 H.R
    - 排阻范围：1\~100KD
    - 更换时间
  - 柱效要求
    - 每米理论塔板数：≥4000
      □ 对称性：0.8\~1.2
 - 缓冲液
  - 平衡缓冲液、洗脱缓冲液
 - 0.05mol/L NaCl-5m mol/L PB
 - 步骤
  - 平衡
    - 上样
    - 洗脱
    - 收集
 - Q&A
  - S-100浓度多少开始收集，浓度多少可以结束，除了浓度收集法，还有什么收集方法？
  - SOP中规定，S-100工序后处理后需要用WFI冲至中性，但因生产计划3天1批导致没有时间冲到中性，然后继续下一批生
    产，是否合规
--- a/海济工艺/杂质研究.md
+++ b/海济工艺/杂质研究.md
@ -0,0 +1,394 @@
 # 药学研究
 物质间相互作用
 ## API
 ## API相关杂质
 稳定性评价变化
 ## 工艺相关杂质
 ## 外来杂质
 # 杂质研究
 最后是要出一份安全性评估报告
 酶切位点
 强制降解
 高温
 强酸、碱
 酶切
 氧化
 # 稳定性
 分子变化
 分子间的相互作用
 # 工艺过程需要控制的杂质
 原辅料
 工程菌
 TRIS
 消泡剂
 盐酸四环素
 # 外来污染物
 内毒素
 微限
 # 包装材料溶出物
 相容性研究范畴
 # 产品相关杂质
 属主来源
 聚合、断裂
 相关蛋白
 高分子蛋白
 - 名称：人生长激素（rhGH）
 - 分子式：C990H1528N262O300S7
 - 氨基酸组成：
  - 氨基酸数量：191个
  - 二硫键数量：2个
  - ![](media/1b68a6fd3f7581e53e5702809957753f.jpeg)氨基酸序列（来源药典）：
 > □
 - 分子量：22 KD
  - 等电点（pH）：5.2
  - 宿主菌：大肠杆菌
  - 分泌部位：
    - 膜内分泌、膜外表达
    - 细胞基质，破壁不破膜
  - 紫外最大吸收波长：276nm
 - 杂质成分
  - 细胞来源污染物
    - 相关蛋白质
    - 高分子蛋白质
 - 工艺步骤简述
  - 一级培养
  - 二级培养
  - 种子罐培养
  - 发酵罐培养
  - 冻结
  - 融化
  - 保存
  - 裂解离心
 - 步骤
  - 敲碎
    - 裂解
 
 > 裂解液缓冲液
 > ◊ 10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH7.5±0.5
 - 缓冲液用量
  □ 菌体质量：缓冲液体积=1kg：8L
 □
 - 超滤浓缩
 - 将敲碎后的菌体加入裂解缓冲液
 - 搅拌时长：≥1h
  离心
 - 温度：4℃
 - 离心力：5324g
 - 留存：上清液
 
 - 盐析
 
 > 超滤膜包孔径：5KD
 > 一次盐析
 - 目的：使蛋白沉淀出来
  □ 温度：2℃\~8℃
 - 硫酸铵用量：45%，227g硫酸铵/L浓缩液
 - 时长：12h以上（生产排班需求）
  - 一次离心
    - 目的：使蛋白沉淀与杂质溶液分离
      □ 温度：4℃
      □ 离心力：9915g
      - 时长：30min
      - 留存：蛋白沉淀
    - 蛋白溶解
      - 目的：使蛋白沉淀溶解
      - 溶解液：10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH 8.0±0.2
    - 二次盐析
      - 目的：使杂蛋白沉淀出来
        □ 温度：2℃\~8℃
      - 硫酸铵用量：20%，114g硫酸铵/L浓缩液
        □ 时长：0.5h\~1h
    - 二次离心
 - G25
 
 - 目的：使目的蛋白溶液与杂质蛋白沉淀分离
  □ 温度：4℃
  □ 离心力：9915g
 - 时长：30min
 - 留存：上清液
  目的
 - 将样品中的盐脱去
 - 层析原理
  - 分子筛
  - 填料性质
    - 名称：Sephadex G 25
  - 缓冲液
    - 平衡缓冲液、洗脱缓冲液
      - 10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH 8.0±0.2
  - 最终蛋白质缓冲体系
    □ 1
 - DEAE1
 - 层析原理
 □
 - 目的
 □
 > 离子交换（弱阴离子交换）
 > 捕获目的蛋白
 - 填料性质
  - 名称：DEAE Sephrose F.F
  - 缓冲液
    - 平衡缓冲液
      - 0.3mol/L Tris-HCl-30m mol/L EDTA
      - 0.04mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
    - 样品调节缓冲液
      - 0.04mol/L NaCl -10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
    - 冲洗缓冲液
      - 0.04mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
    - 洗脱缓冲液
 - Phenyl
 - 0.1mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
 - 层析原理
  - 疏水
  - 填料性质
    - 名称：Phenyl Sepharose F.F
  - 缓冲液
    - 平衡缓冲液
      - 0.7mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
    - 样品调节缓冲液？？？
      - 3.5mol/L (NH4)2SO4溶液、1mol/L Tris-HCl-100mmol/L EDTA
    - 冲洗缓冲液
      - 0.7mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
    - 洗脱液
      - 0.5mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
      - 0.35mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
      - 0.05mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
 - 盐析（去除硫酸铵、Tris，缩小体积）
 - 盐析
 □
 □
 □
 □
 > 目的：使蛋白沉淀出来温度：？
 > 硫酸铵用量：3.5mol/L硫酸铵溶液→硫酸铵终浓度：1.35mol/L～1.83mol/L
 > 时长：10min
 - 一次离心
  - 目的：使蛋白沉淀与杂质溶液分离
    □ 温度：4℃
    □ 离心力：9910g
    - 时长：30min
    - 留存：蛋白沉淀
  - 蛋白溶解
    - 目的：使蛋白沉淀溶解
    - 溶解液：5m mol/L PB pH 7.2±0.1
    - 蛋白浓度：35mg/ml\~50mg/ml
  - 二次离心
    - 目的：使目的蛋白溶液与杂质蛋白沉淀分离
      □ 温度：4℃
      □ 离心力：9910g
 - S-100
 - 时长：15min
 - 留存：上清液
 - 层析原理
  - 分子筛
  - 填料性质
    - 名称：Sephacryl S100 H.R
    - 排阻范围：1\~100KD
  - 缓冲液
    - 平衡缓冲液、洗脱缓冲液
 
 - 步骤
  - 平衡
    - 上样
    - 洗脱
    - 收集
  1. mol/L NaCl-5m mol/L PB
 - DEAE2
 - 目的
 □
 > 捕获目的蛋白
 - 层析原理
  - 离子交换（弱阴离子交换）
    - 填料性质
      - 名称：DEAE Sephrose F.F
      - 缓冲液
        - 平衡缓冲液
          - 200m mol/L PB
          - 5m mol/L PB
        - 样品调节缓冲液
          - 5m mol/L PB
        - 冲洗缓冲液
          - 5m mol/L PB
        - 洗脱缓冲液
          - 0.02mol/L NaCl-5m mol/L PB
          - 0.05mol/L NaCl-5m mol/L PB
          - 0.08mol/L NaCl-5m mol/L PB
 - 超滤浓缩
 - 目的
 □
 - 原理
 □
 > 洗滤除去小分子的盐离子，浓度目的蛋白目的蛋白不能通过超滤膜
 - 超滤膜包
 - 材质
 
 - 孔径
 
 > 聚醚砜
 > 5KD
 - 单块膜包有效面积
 - 0.5m2
  - 最终蛋白缓冲体系
    - G25脱盐（水剂）
      - 层析原理
 - 层析柱的装填
  - 好的层析柱装填→好的层析柱→好的结果
 - Q&A
 ○
 ○
 ○
 > 有的核酸蛋白检测仪不稳定，示数经常漂移，不同的核酸蛋白检测仪测出来的柱效不一样，应该以更稳定的蛋白仪测出的柱效为准？或设备条件？
 > TE溶液的配制为什么需要通过浓硫酸调节pH，是否有其他方式，减少用危险化学用品的使用为什么粗纯缓冲液用TE，精纯缓冲液用PB
 白性质
--- a/海济工艺/水剂G25.md
+++ b/海济工艺/水剂G25.md
@ -0,0 +1,83 @@
 层析原理
 ## 使用1mM PB的目的
 冲走OH离子，层析柱碱洗后使用注水冲洗，但NaOH冲柱会吸附OH根离子，用注水难冲走，所以使用1mM PB
 ## 脱盐的目的
 原液中含有5mM PB，用1mM PB置换可以降低药液中的离子浓度，因为处方中辅料含有大量离子，可能会导致蛋白发生盐析，低盐药液会澄清
 图谱异常
 回顾历史
 毛刺峰：
 管路气泡
 设备故障或不稳定（先确认硬件问题）
 隔膜泵和紫外在一张桌子上，隔膜泵运行过程中震动影响紫外稳定性
 新旧设备串联看差异
 双峰：
 柱子出现干柱（大气泡）
 气泡来源
 操作：
 换管时操作或其他操作跑空引入
 设备：
 密闭性不好
 物料：
 水：含气量高
 压力大、温度低水中含气量高
 未调节水系统时，拆柱过程看到有气泡冒出，调节后看不出了
 制水系统
 提高制水设定限，减少注射用水储罐的空腔体积
 降低循环泵压力，降低循环流速，降低压力
 储水罐的空气滤芯透气量是否满足要求（加热干燥功能）
 注射用水使用点不能放水放太快，出水温度在20~23℃之间，避免温度过低
 怎么测定谁的含气量？使用生产前接水放置，观察产气量
 原因：
 平衡液：
 原液：
 20年原液没有2~8℃冻存，21年原液要冻存后上样
 操作：除NaOH不能过滤芯外，全部过滤芯
 展开
 水溶液制剂也要主要水的含气量→配制→分装到各个小瓶中
 # 措施
 原则：G25跟制剂投料的PB分开，配方体现按原来的不变
 制剂配10mM投料，纯化配0.1M母液配制30L左右够1个月使用的量，有效期要做到1个月
 实际多投的16g另外买1瓶回来，每次称20g补过来，第一次的可以做损耗
 变更与纳音：提高浓度，减少配制次数，提高生产效率
 统计相关涉及文件和工作
--- a/海济工艺/水剂制剂.md
+++ b/海济工艺/水剂制剂.md
@ -0,0 +1,17 @@
 # 洗烘瓶
 工艺目的
 将卡式瓶进行除热原和高温固化硅油
 ## 物料
 二甲硅油乳
 了解所有成分的物理化学性质
 耐受温度、会不会变质或者去除不干净
 成分的残留能否检验
 相容性的研究需要喷硅油的
--- a/海济工艺/生长激素表达.md
+++ b/海济工艺/生长激素表达.md
@ -0,0 +1,31 @@
 # 构建细胞/工程菌时需要考虑纯化
 # 表达位置
 分胞内、胞外
 hGH为分泌间质表达
 表达位置决定了破碎的方法
 # 冻融目的
 使细胞松散
 # 超滤
 先超滤后盐析，因为体积大
 经验值：目的分子（大分子）÷膜孔（5KD，hGh）=1.5倍
 # 盐析
 破坏蛋白亲水性水化膜，暴露疏水核
 影响因素
 蛋白浓度，体系中盐的浓度
 过饱和盐：全部蛋白
 不饱和盐：有目的筛选
--- a/海济工艺/纯化工艺.md
+++ b/海济工艺/纯化工艺.md
@ -0,0 +1,113 @@
 介质原理→关键性能→评估→哪些评价的控制策略→收集数据评价→结果→结论
 构建特性→下游纯化工艺
 裂解为有菌区，后续粗纯为无活菌区（工程菌）
 验证策略控制与工艺设计相关
 属性：分子筛？官能团？
 产品工艺和工艺功能
 功能原理结合蛋白性质来写
 大分子分子筛效应不明显，扩散弱
 柱效：均一性、松紧：对称性，N代表分离能力
 分子筛
 全排阻，N不重要，对成型重要，类似与化工类的蒸馏塔
 脱盐、除色素
 非全排阻（进孔）
 路径不一样
 反压大→碎胶多→装柱效果差→筛胶
 日常维护（装填、封存）
 清洁（前后处理、CIP）
 # 来源类型
 天然
 表达
 # 踏板
 引用化工蒸馏的概念
 # 装柱工艺
 # 柱效测定
 小分子扩散探测评价介质分布情况
 图谱（吸附类的）：产品来评价吸附，官能团多少直接影响吸附能力和分离能力
 柱效
 定期测柱效的标准
 合格限
 行动限
 警戒限
 中间柱效变化由图谱体现，如果中间某次图谱异常，怎么办？监测下样液合格即可放行？
 上样液可以过滤，减少柱子的压力，延长层析柱的使用寿命
 柱头膜堵塞
 反向冲洗、超声波冲洗，目视看不出来
 柱壳问题，正向上样不行，可以尝试反向上样
 缓冲液中，EDTA（金属螯合剂，抢夺酶的金属离子）抑制酶的作用
 # 工艺参数
 柱桶规格
 柱高
 柱内直径
 径高比
 上样载量（体积）：上样体积大，滞留时间长
 上样浓度：浓度高，热扩散明显，蛋白的溶解上限
 样品状态：粘度、颗粒物
 基线：规定基线范围
 柱效要求
 线性流速：流速高，介质耐受问题；流速低，滞留时间长，分离度差
 缓冲体系
 柱温（以流出液温度为准）和环境温度
 # 洗脱
 分离度：连续梯度洗脱优于恒定洗脱
 恒定洗脱
 连续梯度洗脱
 手工较难实现，一般通过设备实现
 # 图谱
 根据图谱可以反推柱子和样品的状态
--- a/海济工艺/超滤.md
+++ b/海济工艺/超滤.md
@ -0,0 +1,37 @@
 >   超滤
 >   2021年6月24日 21:49
 -   超滤浓缩
 -   目的
 □
 -   原理
 □
 >   洗滤除去小分子的盐离子，浓缩目的蛋白目的蛋白不能通过超滤膜
 -   超滤膜包
 -   材质
 
 -   孔径
 
 >   聚醚砜
 >   5KD
 -   单块膜包有效面积
    -   0.5m2
    -   最终蛋白缓冲体系
 >   分区 层析 的第 1 页
--- a/盐析.md
+++ b/盐析.md
@ -0,0 +1,42 @@
 >   盐析
 >   2021年6月24日 20:20
 -   盐析
 ○
 ○
 >   定义
 -   在蛋白质水溶液中加入中性无机盐，随着盐浓度增大而使蛋白质沉淀出来的现象，
    得到的蛋白质一般不失活，一定条件下游客重新溶解
    -   中性盐是强电解质，溶解度大，在蛋白质溶液中，与蛋白争夺水分子，破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜，同时大量中盒蛋白质颗粒上的电荷，使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出
    -   常用的中性盐有硫酸铵（使用最多）、氯化钠、硫酸钠等原理
    -   破坏蛋白质的水化层
 >   □ 在高浓度的中性盐溶液中，由于盐离子亲水性比蛋白质强，争夺了蛋白质的
 >   水化层，引起蛋白质溶解度降低
 -   中和了蛋白质所带的电荷
 □
 -   影响因素
    -   pH
 □
 >   强电解质的中性盐，解离作用强，盐的解离可抑制蛋白质弱电解的解离，使蛋白质所带电荷减少，更容易聚集析出
 >   pH越接近蛋白质的等电点，蛋白质就越容易沉淀
 -   离子强度
 >   分区 层析 的第 1 页
--- a/紫外分光光度计.md
+++ b/紫外分光光度计.md
@ -0,0 +1,10 @@
 * 吸收光谱法基本定律
    物质对单色光吸收的强弱与吸收物质的浓度（C）和液层厚度（l）间的关系的定律，是光吸收的基本定律，是紫外-可见光度法定量的基础。
 * Lamber-Beer定律
    当一束平行的单色光通过溶液时，溶液的吸光度（A）与溶液的浓度（C）和光程（b）成正比。
        一般情况下光程（b）=液层厚度（l）
        A=ECl
            A：吸光度
            E：吸光系数，吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度
            c：浓度：
            l：厚度，单位cm
--- a/蛋白质的性质/蛋白质分离纯化的一般原则.md
+++ b/蛋白质的性质/蛋白质分离纯化的一般原则.md
@ -0,0 +1,33 @@
 蛋白质分离纯化的一般原则
        -   蛋白质的分离步骤
            -   生物组织的机械破碎
                -   研磨法
                -   超声波法
                -   冻融法
                -   酶解法
            -   根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提
                -   水溶性蛋白：中性缓冲液抽提
                -   酸性蛋白：稀碱性溶液抽提
                -   脂溶性蛋白：表面活性剂抽提
            -   粗提
                -   离心去除固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质制品
            -   精制
                -   可用层析法、电泳法等进行精制
            -   成品加工
                -   测定蛋白质的性质并干燥成成品
--- a/蛋白质的性质/蛋白质分离纯化的方法.md
+++ b/蛋白质的性质/蛋白质分离纯化的方法.md
@ -0,0 +1,175 @@
 -   蛋白质的分离纯化方法
            -   根据分子大小不同的纯化方法
                -   透析
                    -   透析利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质，如无机盐、单糖等分开
                    -   常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢纸、火绵纸和其他改型的纤维素材料
                    -   透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降低到最小值为止
                -   超滤
                    -   超滤是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的
                -   密度梯度（区带）离心
                    -   蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度
                    -   蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管（常用塑料管）中分离成各自独立的区带，分成区带的蛋白质可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分部收集
                -   凝胶过滤
                    -   凝胶过滤层析，亦称分子排阻层析或凝胶渗透层析、分子筛层析
                    -   分子筛是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一
                    -   原理
                        -   当不同大小的蛋白质流经分子筛时
                        -   比胶粒内部孔径大的分子不能进入胶粒内部网状结构，而被排阻在胶粒之外随着溶剂在胶粒之间的孔隙向下移动，行程较短，最先流出柱外
                        -   比胶粒内部孔径小的分子能不同程度地经过胶粒内外，行程较长，后面流出柱外
    -   利用蛋白质溶解度差别的纯化方法
        -   定义
            -   利用蛋白质溶解度的差别来分离纯化蛋白质是实践中最常用的方法
            -   在同一的特定外部条件下，不同蛋白质据哟不同的溶解度，这是因为蛋白质溶解度归根结底取决于它们本身的分子结构。根据蛋白质分子结构的特点，适当地改变外部因数，就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度，作为分离和纯化蛋白质的一种手段
                -   例如分子所带电荷的性质和数量
                -   亲水基团和疏水基团的比例，它们在蛋白质分子表面的排列以及由此而产生的偶极矩等
            -   影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有
                -   溶液的pH
                -   离子强度
                -   介电常数
                -   温度
        -   等电点沉淀和pH控制
            -   蛋白质是带有正电荷和负电荷基团的两性电解质，带点基团的电荷数量则因为pH不同而变化。蛋白质处于等电点时，其净电荷为0，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀
            -   当pH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分或全部将沉淀出来，那些等电点高于或低于该pH值的蛋白质则仍留在溶液中
            -   这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中
        -   蛋白质的盐溶和盐析
            -   盐溶：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度
            -   盐析：当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来
        -   有机溶剂分级分离
            -   与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性
        -   温度戳蛋白质溶解度的影响
            -   0\~40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，如人的血红蛋白从0到25℃，溶解度随温度上升而降低
            -   40℃\~50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般中性pH介质中即失去溶解力。
            -   大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低温度下进行
        -   例子
            -   分离血浆蛋白质的一个常用而有效的方法是调节pH使溶液从中性逐渐变成酸性，同时控制乙醇浓度和离子强度以扩大各种蛋白质溶解度的差别，使血浆中不同的蛋白质先沉淀出来
    -   根据电荷不同的纯化方法
        -   电泳
            -   电泳：在外电场的作用下，带点颗粒，如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动
            -   区带电泳由于在支持物上电泳时蛋白质混合物被分离成若干区带而得名。区带电泳具有设备简单，操作方便，样品用量少等优点，是蛋白质分析分离的常用技术。
            -   按支持物的物理性状不同分为4类
                -   滤纸电泳和薄膜电泳（醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳）
                -   粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板
                -   细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝电泳，这是一类微量电泳
                -   凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙酰胺和琼脂糖凝胶，前者适合分离蛋白质和多核苷酸，后者适合分离核酸，这两种凝胶电泳的分辨率都很高
        -   双向电泳
        -   电泳的基本操作
        -   聚丙烯酰胺凝胶电泳
        -   毛细管电泳
        -   等电聚焦
        -   层析聚焦
            -   根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物
            -   原理
                -   用特种多缓冲液（Polybuffer，含多种两性电解质）滴洗填充在柱中的特种多缓冲交换剂时，就会在层析柱中自上而下自动建立连续的pH梯度
                -   加载柱上端的蛋白质样品也随多缓冲液的展开按各自的等电点聚焦在响应的pH区段
                -   在展开过程中随pH梯度下移，蛋白质混合物的各组分先后从柱中流出，达到分离纯化的目的
        -   离子交换层析
            -   利用蛋白质和核酸大分子层析的支持介质纤维素离子交换剂和交联葡萄糖离子交换剂
            -   交联葡萄糖离子交换剂（Sephadex ion exchanger）
            -   阴离子交换层析
                -   将阴离子交换树脂颗粒填充在层析柱中，由于阴离子交换树脂颗粒上带有正电荷，能吸引溶液中的阴离子。
                -   再用含阴离子的溶液洗脱
                -   含负电量小的蛋白质先被洗脱下来，增加阴离子浓度，含负电量较多的蛋白质后被洗脱下来
    -   利用选择性吸附的纯化方法
        -   利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的
        -   羟磷灰石层析
            -   用于分离蛋白质或核酸，分开单链DNA和双链DNA
        -   疏水作用层析
            -   原理：蛋白质存在与水分子表面的疏水氨基酸残基的数量是不同的，利用蛋白质表面的疏水性差别
            -   疏水层析的问题：某些洗脱条件可引起蛋白质变性
    -   利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法
        -   亲和层析
            -   利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，即生物学亲和力
                -   抗原和抗体
                -   激素和受体蛋白
                -   凝集素和糖蛋白
    -   高效液相层析
        -   高效液相层析（HPLC）
    -   反向HPLC
        -   固定相是非极性的，流动相是相对极性的，用于分离药物及代谢物、杀虫剂、氨基酸和肽等非极性化合物
--- a/蛋白质的性质/蛋白质的性质.md
+++ b/蛋白质的性质/蛋白质的性质.md
@ -0,0 +1,103 @@
 蛋白质的酸碱性质
        -   蛋白质的点解性质
            -   蛋白质分子是由氨基酸组成的，在蛋白质分子包含有游离的末端α-氨基和α-羧基以及测量上的各种功能团。因此蛋白质同氨基酸一样也是一类两性电解质，既能和酸作用也能和碱作用。但是蛋白质分子的可解离基团主要来自侧链上的功能团
            -   蛋白质的等电点（pl）
                -   蛋白质等电点是指蛋白质所带的正电荷总数与负电荷总数相等，也就是净电荷为0时的pH。在等电点pH时，同氨基酸一样，蛋白质在电场中即不向正极移动，也不向负极移动。并且在等电点时，其净电荷为0，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀，蛋白质的溶解度最小，
                -   当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷
            -   蛋白质的等离子点（类似于等电点）
                -   等离子点是指在没有其他盐类干扰的情况下，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH，是蛋白质的一个特征常数
        -   蛋白质分子的大小与形状
            -   根据化学组成测定最低相对分子质量
                -   用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子。则可以由此计算出蛋白质的最低相对分子质量
            -   渗透压法测定相对分子质量
            -   蛋白质的扩散和扩散系数
            -   沉降分析测定相对分子质量
            -   凝胶过滤法测定相对分子量
                -   凝胶过滤层析可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，同时可以测定蛋白质分子量。蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关
                -   先测得几种标准蛋白质的Ve（洗脱体积），并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量
            -   SDS-PAGE电泳法测定相对分子质量
                -   在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于他的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关
                -   电泳迁移率与蛋白质分子量的对数值线性相关
                -   SDS-PAGE只能测定亚基的相对分子质量
                -   SDS是一种有效的变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和熟睡作用，而巯基乙醇能打开二硫键，因此在SDS和巯基乙醇存在下，单体蛋白质或亚基（寡聚蛋白质解离成亚基）的多肽链处于展开状态
                -   SDS与蛋白质结合
                    -   使多肽链覆盖上相同密度的负电荷，该电荷量远超出蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质之间原有的电荷差别，结果所有的SD-蛋白质复合体，电泳时都以相同的电荷/蛋白质比向正极移动，分子量小的蛋白质跑得快
                    -   改变了蛋白质单体分子的构想，SDS-蛋白质复合体在水溶液中的形状被认为是近似雪茄烟形的长椭圆棒
    -   蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（分子量由小变大：溶液→胶体→沉淀）
        -   蛋白质的胶体性质
            -   蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液
            -   蛋白质分子的颗粒直径已大1-100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质
            -   蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素
        -   蛋白质的沉淀
            -   蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的
            -   如果条件发生变化，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。
            -   蛋白质溶液的稳定性的因素有质点的大小、电荷和水化作用
            -   沉淀蛋白质的方法
                -   例如在蛋白质溶液中加入脱水剂以除去它的水化层，或者改变溶液的pH达到蛋白质的等电点使质点失去携带相同净电荷或加入电解质破坏双电层，那么蛋白质分子就会凝集成大的质点而沉淀
                -   盐析法
                    -   向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析一般不会引起蛋白质变性，当除去盐后，复可溶解
                -   有机溶剂沉淀法
                    -   向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带点质点间的相互租用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀
                -   重金属盐沉淀法
                    -   当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，容易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等）结合成不溶性盐而沉淀
                    -   误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救就是因为这点，然后再服用催吐剂排除体外，重金属盐常能使蛋白质变性，这可能是因为重金属盐水解生产酸或碱的缘故
                -   生物碱试剂和某些酸类沉淀法
                    -   生物碱试剂：能引起生物碱沉淀的一类试剂。
                    -   当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，与生物碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀
                    -   这类沉淀反应经常被临床检验部门用来除去体液中干扰测定的蛋白质
                -   加热变性沉淀法
                    -   加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层
                    -   我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含MgCl2）的制豆腐的方法
                -   等电点沉淀
                    -   蛋白质溶液处于等电点时，溶解度最小
--- a/超滤（切向流过滤）.md
+++ b/超滤（切向流过滤）.md
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 -   微滤
    □ 用途：除颗粒澄清过滤
    -   超滤
 -   原理
    -   以压力为推动力，以大分子与小分子分离为目的，膜孔径在20\~1000A之间
    -   水溶液在压力推动下，流经超滤膜表面，小于膜孔的溶剂及小分子溶质透过超滤膜，成为净化液，比膜孔大的溶质被截留，随水流排出，成为浓缩液
    -   溶质被膜截留，水分子穿过膜，溶质得以浓缩
    -   超滤过程为动态过程，分离是在流动状态下完成的。
 -   特点
    -   低渗透膜
    -   不控制滤速，切向流降低滤膜堵塞
    -   先优化通量/过膜压力
 -   用途：分子尺寸进行浓缩、分离
 -   ![](media/107e5fcbb087a6d1ef9455ff17f6081a.jpeg)超滤流路设计
 >   
 -   超滤浓缩
    -   特点
        ◊ 缓冲液条件不改变
        ◊ 生物分子不改变
        ◊ 相对快速和高回收率
    -   示意图
 >   ![](media/519def71ab73eb276e6d5993ea93bb57.jpeg)◊
 -   超滤系统的关键部件
    -   膜包夹持器
    -   超滤膜包
        -   ![](media/39c67269851aff952da6d3928fe61c00.jpeg)膜包图片
 >   ◊
 >   ![](media/226c46fd53c992b01e68ca6b748c855d.jpeg)◊
 >   ![](media/4f7aad91fc8e13eb3b952344650fa9c3.jpeg)◊
 -   膜包构造示意图
 >   ![](media/e9a910f3af126e1576499e0a440c1f91.jpeg)◊
 -   超滤膜包的选择
    ◊ 超滤膜包流道的选择
    ![](media/4502dea5974b44fabfc7b2fb59b4bfa3.jpeg) 网状流道
 –
 >    架空筛网流道
 ![](media/b79f28e591229387e711b4be294c7166.jpeg)–
 >   膜包有效过滤面积
 >   滤出液流速（典型为
 >   50L/h）
 >   回流流速建议值，网状流道
 >   起始样品体积范围
 >   最小浓缩体积
 >   
 >   ◊ 选择合适的额定截留分子量（KD）
 >   
 >   根据超滤的目标，选择的滤膜孔径通常要比需要保留在溶液中的相关分子小3至6倍，同时比溶液中一种分子大3至6倍，以保证这种分子能通过滤膜
 -   超滤膜包的水通量测试
    -   目的：
    -   方法：参考厂家的膜包使用手册，每次控制的条件一致
    -   测试节点
        -   初次使用前
        -   每次使用后
 -   超滤膜包的完整性测试
    -   目的：
    -   方法：参考厂家的膜包使用手册，每次控制的条件一致
        
    -   洗滤
 -   用途：降低、去除或替换样品中小分子的工艺
 -   可以是连续或不连续工艺，连续洗滤工艺效率高于不连续洗滤工艺
 -   洗滤体积
    -   初始体积：洗滤前开始料液体积
    -   洗滤体积：加入等体积水或缓冲液，再浓缩至初始体积，称为一个洗滤体积
 -   不连续洗滤
 >   ![](media/c03cb62ffcf729ede9ca23ff2953e3fb.jpeg)◊
 -   ![](media/5819f99ea1ea2639b64471c8dd31a6bf.jpeg)连续洗滤流路设计
 >   ◊
 -   浓差极化
    -   现象
        -   被截留的溶质在膜表面不断累积，达到某一极限时即生成凝胶层，使膜的透水量急剧下降
        -   解决措施
            -   提高膜面水流速度，以减小边界厚度，并使被截留的溶质及时由水带走
            -   采取物理或化学的洗涤措施
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							`- 压力`

							`- 跟颗粒直径有很大的关系，小颗粒反压大，柱高高反压大`
		`@ -0,0 +1,3 @@`
							`- 平均粒径（dp）`

							`- 介质的平均粒径（average bead diameter）`
		`@ -0,0 +1,3 @@`
							`- 柱床高度（L）`

							`- 层析柱装填好之后介质的高度，单位为cm`