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亲和层析
2021年6月24日 21:50
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亲和层析
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基本原理
◊ 定 义
◊ 通过生物分子之间的特异性的识别并相互作用来分离纯化物质
◊ 如酶和底物、抗原和抗体之间专一的相互作用
◊ 将其一作为配基固定在填料上，就可以从初始样品中吸附相应的生物分子， 通过洗脱将其解离达到纯化的目的
◊ 优势特点
◊ 能够完成一般方法很难完成的分离
◊ 经常可以一步达＞90%的纯度
◊ 高选择性
◊ 高分辨率
◊ 高结合载量
◊ 快速将目标蛋白与大量杂质分离
◊ 填料结构
◊ 较长的间隔臂
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层析步骤
◊ 一般操作步骤和层析图谱
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◊ 上样前的样品优化
◊ 加强目的分子与配基之间的特异性亲和力
上样前，过滤或离心样品以去除颗粒性固体成分
调节样品的pH、盐浓度和添加剂来提高结合的效率
通过脱盐柱置换缓冲液，去除能影响结合的物质
◊ 样品洗脱方式
◊ 打破目的分子和配基之间的亲和力
常规洗脱
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改变缓冲液的组成
- 高盐洗脱
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使用极端pH或者变性剂
低pH缓冲液冲洗抗体
竞争洗脱
加入目的分子类似物
- 加入配基类似物
图 片
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应用举例
◊ 标签蛋白亲和层析
◊ 基本原理
◊ 亲和标签的种类
短肽类小标签
大标签
双标签
图 片
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◊ His标签蛋白的纯化
Ni填料结构和His标签亲和原理
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常规的His标签蛋白纯化填料
结合液咪唑浓度的摸索
Ni填料离心柱快速筛选
预装柱线性梯度洗脱
Ni柱之后的精纯（一般接分子筛）
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Ni Sepharose excel
用于纯化大体积分泌蛋白
耐酸耐碱、耐EDTA、耐还原剂
金属离子的筛选
IMAC Sepharose
TALON Superflow-纯度最高
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◊ Strep（Ⅱ）和两联Strep（Ⅱ）标签蛋白的纯化
原理和介绍
原理及特点
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纯化实例
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◊ GST标签蛋白的纯化
填料结构和亲和原理
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特 点
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GST填料的结合和洗脱
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填料的种类
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GST标签的酶切
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使用PreScission酶对GST标签蛋白进行柱上酶切
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洗脱后酶切前的分子筛精纯
去除且不开的高聚组份
其他条件优化
降低上样流速有利于目的分子结合
提高样品浓度有利于目的分子结合
杂质对于纯度的影响
杂质可能结合目的蛋白而非GST标签和GST层析柱
Cytiva全流程GST标签融合蛋白解决方案
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◊ MBP标签蛋白的纯化
填料结构和亲和原理
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特 点
纯化实例
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双标签蛋白的纯化
N和C端各连接一个标签
◊ 抗体亲和层析
◊ 抗体的结构
◊ Protein G填料特点
◊ Protein A填料特点
◊ Protein A和Protein G蛋白与抗体亚型的亲和力
◊ MabSelect家族
发展历史
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不同比较
MabSelect PrismA综合性能最佳
对人lgG可达80mg/ml载量
碱洗CIP300循环下仍可保持高载量
强碱NaOH对层析填料的清晰效果
图片
◊ 耐碱配基的研发过程
◊ 纯化实例
Protein A填料
图谱和电泳
pH和离子强度的优化
Protein G填料
- 图谱和电泳
耐碱的MabSelect SuRe填料
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耐碱的载量最高的MabSelect PrismA填料
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◊ 工业生产工艺路线
◊ 抗体片段亲和层析
抗体片段的结构
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Capto L填料
配基为Protein L
实例
替代方案
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KappaSelect&LambdaFabSelect填料
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◊ lgM的纯化
◊ lgY的纯化
◊ 族特异亲和层析
◊ 填料的种类
◊ Con A和Lentil Lectin填料捕获含多糖物质
◊ 细胞外膜蛋白质组的提取
◊ 预活化亲和层析
◊ 预活化填料共价偶联配基去吸附目标分子
◊ 填料的特点
◊ 利用TNF-α的抗体片段作为配基纯化TNF-α
◊ 草酸作为配基从肾脏中垂钓草酸结合蛋白