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> 分子筛
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> 2021年6月24日 19:45
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- 凝胶过滤层析(又称分子筛、分子排阻)
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- 构成
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◊ 柱形:瘦高
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◊ 填料:多孔球状基架
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◊ 颗粒直径范围:8.6\~200μm
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◊ 材质:交联的多糖
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![](media/307966641ed5c3816041cdf4132a341e.jpeg)◊ 图 片
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- 分离原理
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◊ 根据分子大小和形状的差异进行分离的一种简单可靠的层析技术
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![](media/e80fa17cdb16a6fd774bc767a40b0f31.jpeg)◊ 图 片
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- 分离特点
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◊ 分子量、形状、体积大小影响进孔能力及出峰体积
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◊ 大分子先出,小分子后出
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◊ 提高选择性和柱效
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◊ 只需要一种缓冲液
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◊ 容易操作
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◊ 凝胶过滤
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◊ 脱盐置换缓冲液
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◊ 体积排阻
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◊ 分子量相差2倍以上,分离效果才会好
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◊ 蛋白质溶液脱盐
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◊ 添加到150mM NaCl的盐到流动相中以消除分子和填料间的作用对结果的干扰
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◊ 蛋白复性
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- 层析步骤
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◊ 平衡→上样→洗脱→清洗/保存
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- 层析图谱
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![](media/385d68dbc6250546154eca91de9af60d.jpeg)
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- 相关特性
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![](media/3d15099b5287bc9b0b6196afb37ecf2f.jpeg)◊
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样品的分子量Mr与出峰体积Ve一一对应
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> ![](media/cd72f6910155ca63fcd1092430a456aa.jpeg)◊
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> 样品分子量Mr决定样品的入孔能力系数Kd
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> ◊ 样品分子量Mr与出峰体积Ve(入孔能力Kav)之间的关系
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![](media/9317554c943867e938f1df8257bf7903.jpeg)
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> ![](media/76b65190af62629c1edabe3451db3c35.jpeg)◊
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> 凝胶过滤层析填料的分离范围:a值
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> ![](media/538c6e3fc20784bd32f0012bce356de3.jpeg)◊
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> 凝胶过滤层析填料的分辨率(选择性):b值
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> ◊ 凝胶过滤层析填料的a值和b值的拟合测定
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> ![](media/c80e2b79048a08c26dfa1cb960af1d86.jpeg)◊
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- 凝胶过滤层析的条件优化(影响因素)
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![](media/31bd126911bbf43ac048a11687a4f21e.jpeg)◊ 填料的孔径与选择性
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> ![](media/c94f7826bb8e22e6621569d4a4b36118.jpeg)◊ 柱高与分辨率(选择性)
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> ◊ 运行流速与峰宽(有效性)-影响因素
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![](media/00a9a48797b825657ee7c79c0f35329e.jpeg)
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> ![](media/70c8dc150067d92e07baff8977fb54a3.jpeg)◊
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> 运行流速与峰宽(有效性)-层析速率方程
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> ![](media/7308f8e1488baae1cc3a6bfe177a93bc.jpeg)◊
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> 运行流速与峰宽(有效性)-实例
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> ◊ 填料的粒径与选择性
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![](media/7f8f93c110453f83f8108933e7471bbb.jpeg)
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> ![](media/d498424d8e5066f7c485a3ba84562622.jpeg)◊ 填料的装填柱效与有效性
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> ![](media/c12621323f5e9b2090a083b54e80c107.jpeg)◊ 上样体积和上样浓度
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> ◊ 样品和缓冲液的粘度
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![](media/7675badbac0a2b5e1c681d166baa8c73.jpeg)
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> ![](media/77d2478ce5f4d89db4ac7ab1d5278671.jpeg)◊ 缓冲液的成分
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> ![](media/e58c77e80df03b40417f991a13a5cea7.jpeg)◊ 层析柱接线管路的长度和直径
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- 主要作用
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◊ 蛋白精纯、样品筛选鉴定、疫苗纯化和质控、样品换液
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- 常见凝胶过滤应用及填料选择
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◊ S 系
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> ![](media/c26cdace70b727e7dc29210d46b83bf1.jpeg)◊
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> ◊ Sephadex G系列
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> ◊
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> ◊ Superdex系列
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> ◊
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> ◊ Superose系列
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> ◊
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> ![](media/c8885af27d18bc5f8d8c389d1446aaa8.jpeg)◊ Sepharose系列
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> ◊
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> ◊ 1
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> ◊ Sephacryl系列
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- 层析柱的使用
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◊ 凝胶过滤层析柱的运行参数及填料数据
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◊ 可找供应商要
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◊ 凝胶过滤层析柱的装填
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◊ 两部流速填装(不要超压)
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> ![](media/f3f6c584c5d8dd44e6fabb59232398c0.jpeg)
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- 层析柱的反向清洗
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![](media/ca29b3cf56965d557d7e71b3ed654f40.jpeg)◊
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多次使用后填料会变脏,反压会变大
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> ◊
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> ◊ 一般10次\~20次进行一次反向清洗(柱子下端较上端洁净)
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- ![](media/b74a33f5cf6531e77093a84b191e280c.jpeg)层析柱的保存
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> ◊
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> ◊ 1
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- 层析柱滤膜的更换
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◊ 如果在清洗后层析柱依然很脏、反压很大则可以更换上端的滤膜
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> ![](media/00c0151810bcc7f051d93b745b5573f0.jpeg)◊
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