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疏水作用层析
2021年6月24日 21:49
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疏水相互作用层析（盐析原理）
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基本原理
◊ 基本定义
◊ 根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白质和层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离物质
◊ 高盐上样，低盐洗脱
◊ 熵增驱动
◊ 反向层析
◊ 蛋白与反相介质表面更强的疏水作用导致更强的蛋白保留，因而通过与水混溶的有机修饰剂如乙腈、乙醇、甲醇或异丙醇洗脱蛋白
◊ 蛋白质的疏水性
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氨基酸是蛋白质的基本组成单位，不同的氨基酸具有不同的疏水性侧链
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◊ 理论上，蛋白质疏水性的侧链被包裹在蛋白质内部，但是由于周围热力学稳定的要求，蛋白质的结果会随所处的环境变化而变化，因此有部分疏水侧链 暴露在蛋白质表面，形成疏水区域
◊ 影响蛋白质疏水的因素有：离子强度、pH、温度、溶剂种类
◊ 蛋白质表面既有疏水性区域也有亲水性区域
◊ 水分子的极性和作用
◊ 水是一种极性分子
◊ 亲水作用和疏水作用
◊ 盐的添加与可逆相互作用
◊ 疏水性的平衡主要由盐控制（高盐结合、低盐分离）
◊ 由分离到结合是一个熵增的过程（无需水分子增加，自发的过程）
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层析步骤
◊ 高盐上样，低盐洗脱
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条件优化（影响因素）
◊ 层析设备的选择
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◊ 缓冲液的选择
◊ 溶质种类
◊ 合适的离子强度
离子强度决定样品的吸附或者流穿
不同的离子强度表现出不同的选择性
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◊ 初次试验条件推荐
结合缓冲液：50mM PBS pH7.0，含有1~1.5M硫酸铵
洗脱缓冲液：50mM PBS pH7.0
◊ 合适的添加剂
提高疏水相互作用层析分离的添加剂
含有添加剂的缓冲液进行空白梯度洗脱，检查他们对洗脱图谱的影响
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◊ 层析填料的选择
◊ 基架的选择
◊ 不同样品具有不同的疏水性（不可预测）
◊ 配基类型
◊ 配基密度（配基偶联密度）
◊ 快速筛选填料
◊ 样品的准备
◊ 样品最好溶解到起始缓冲液中
◊ 可以直接向样品中加盐，提高电导率
◊ 小体积可使用脱盐柱上进行缓冲液置换
◊ 过滤和离心来去除不溶物，防止堵塞层析柱
◊ 洗脱方式的选择（类离子交换）
◊ 梯度洗脱
◊ 步级洗脱
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◊ 填料的清洗和再生
◊ 再 生
◊ CIP
◊ 保 存
◊ 影响试验的其他因素
◊ 温度影响（尽量在室温下进行）
◊ 流速影响（流速慢分辨率高）
◊ 其他情况分析
目的蛋白在梯度里很早洗脱，分辨率差
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高盐浓度起始环境下，重复进行分离
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使用由更强盐析作用的盐
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更换配基
目的蛋白在梯度末端洗脱，分辨率差
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低一些盐浓度的起始缓冲液条件
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弱一些盐析作用的盐
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更换配基
目的蛋白在梯度中间洗脱，分辨率差
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分段梯度，在目的蛋白用更缓的梯度进行
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使用添加剂提高分辨率
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后续使用其他层析技术分离
图 片
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疏水层析在纯化工艺中的位置
◊ 盐析和变复性，高盐除核酸之后
◊ 离子交换交替使用
应用举例
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