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> 疏水作用层析
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> 2021年6月24日 21:49
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- 疏水相互作用层析（盐析原理）
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- 基本原理
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◊ 基本定义
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◊
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根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白质和层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离物质
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◊ 高盐上样，低盐洗脱
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◊ 熵增驱动
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◊ 反向层析
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◊
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蛋白与反相介质表面更强的疏水作用导致更强的蛋白保留，因而通过与水混溶的有机修饰剂如乙腈、乙醇、甲醇或异丙醇洗脱蛋白
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◊ 蛋白质的疏水性
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◊
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氨基酸是蛋白质的基本组成单位，不同的氨基酸具有不同的疏水性侧链
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> ◊
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> 理论上，蛋白质疏水性的侧链被包裹在蛋白质内部，但是由于周围热力学稳定的要求，蛋白质的结果会随所处的环境变化而变化，因此有部分疏水侧链
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> 暴露在蛋白质表面，形成疏水区域
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> ◊ 影响蛋白质疏水的因素有：离子强度、pH、温度、溶剂种类
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> ◊
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> 蛋白质表面既有疏水性区域也有亲水性区域
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> ◊ 水分子的极性和作用
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> ◊ 水是一种极性分子
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> ◊ 亲水作用和疏水作用
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> ◊ 盐的添加与可逆相互作用
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> ◊
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> 疏水性的平衡主要由盐控制（高盐结合、低盐分离）
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> ◊
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> 由分离到结合是一个熵增的过程（无需水分子增加，自发的过程）
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- 层析步骤
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◊ 高盐上样，低盐洗脱
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> ◊
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- 条件优化（影响因素）
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◊ 层析设备的选择
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> ◊
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> ◊ 缓冲液的选择
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> ◊ 溶质种类
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> ◊ 合适的离子强度
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> 离子强度决定样品的吸附或者流穿
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> 不同的离子强度表现出不同的选择性
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> ◊ 初次试验条件推荐
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> 结合缓冲液：50mM PBS pH7.0，含有1\~1.5M硫酸铵
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> 洗脱缓冲液：50mM PBS pH7.0
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> ◊ 合适的添加剂
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> 提高疏水相互作用层析分离的添加剂
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> 含有添加剂的缓冲液进行空白梯度洗脱，检查他们对洗脱图谱的影响
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> ◊ 层析填料的选择
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> ◊ 基架的选择
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> ◊ 不同样品具有不同的疏水性（不可预测）
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> ◊ 配基类型
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> ◊ 配基密度（配基偶联密度）
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> ◊ 快速筛选填料
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> ◊ 样品的准备
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> ◊ 样品最好溶解到起始缓冲液中
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> ◊ 可以直接向样品中加盐，提高电导率
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> ◊ 小体积可使用脱盐柱上进行缓冲液置换
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> ◊ 过滤和离心来去除不溶物，防止堵塞层析柱
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> ◊ 洗脱方式的选择（类离子交换）
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> ◊ 梯度洗脱
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> ◊ 步级洗脱
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> ◊
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> ◊ 填料的清洗和再生
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> ◊ 再 生
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> ◊ CIP
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> ◊ 保 存
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> ◊ 影响试验的其他因素
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> ◊ 温度影响（尽量在室温下进行）
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> ◊ 流速影响（流速慢分辨率高）
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> ◊ 其他情况分析
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> 目的蛋白在梯度里很早洗脱，分辨率差
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- 高盐浓度起始环境下，重复进行分离
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- 使用由更强盐析作用的盐
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- 更换配基
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目的蛋白在梯度末端洗脱，分辨率差
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- 低一些盐浓度的起始缓冲液条件
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- 弱一些盐析作用的盐
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- 更换配基
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目的蛋白在梯度中间洗脱，分辨率差
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- 分段梯度，在目的蛋白用更缓的梯度进行
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- 使用添加剂提高分辨率
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- 后续使用其他层析技术分离
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 图 片
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- 疏水层析在纯化工艺中的位置
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◊ 盐析和变复性，高盐除核酸之后
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◊ 离子交换交替使用
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- 应用举例
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