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药学研究

物质间相互作用

API

API相关杂质

稳定性评价变化

工艺相关杂质

外来杂质

杂质研究

最后是要出一份安全性评估报告

酶切位点

强制降解

高温

强酸、碱

酶切

氧化

稳定性

分子变化

分子间的相互作用

工艺过程需要控制的杂质

原辅料

工程菌

TRIS

消泡剂

盐酸四环素

外来污染物

内毒素

微限

包装材料溶出物

相容性研究范畴

产品相关杂质

属主来源

聚合、断裂

相关蛋白

高分子蛋白

名称：人生长激素（rhGH）
分子式：C990H1528N262O300S7
氨基酸组成：
- 氨基酸数量：191个
- 二硫键数量：2个
- 氨基酸序列（来源药典）：

□

分子量：22 KD
- 等电点（pH）：5.2
- 宿主菌：大肠杆菌
- 分泌部位：
  - 膜内分泌、膜外表达
  - 细胞基质，破壁不破膜
- 紫外最大吸收波长：276nm
杂质成分
- 细胞来源污染物
  - 相关蛋白质
  - 高分子蛋白质
工艺步骤简述
- 一级培养
- 二级培养
- 种子罐培养
- 发酵罐培养
- 冻结
- 融化
- 保存
- 裂解离心
步骤
- 敲碎
  - 裂解



裂解液缓冲液

◊ 10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH7.5±0.5

缓冲液用量

□ 菌体质量：缓冲液体积=1kg：8L

□

超滤浓缩
将敲碎后的菌体加入裂解缓冲液
搅拌时长：≥1h

离心
温度：4℃
离心力：5324g
留存：上清液



盐析



超滤膜包孔径：5KD

一次盐析

目的：使蛋白沉淀出来

□ 温度：2℃~8℃
硫酸铵用量：45%，227g硫酸铵/L浓缩液
时长：12h以上（生产排班需求）
- 一次离心
  - 目的：使蛋白沉淀与杂质溶液分离
    
    □ 温度：4℃
    
    □ 离心力：9915g
    - 时长：30min
    - 留存：蛋白沉淀
  - 蛋白溶解
    - 目的：使蛋白沉淀溶解
    - 溶解液：10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH 8.0±0.2
  - 二次盐析
    - 目的：使杂蛋白沉淀出来
      
      □ 温度：2℃~8℃
    - 硫酸铵用量：20%，114g硫酸铵/L浓缩液
      
      □ 时长：0.5h~1h
  - 二次离心
G25



目的：使目的蛋白溶液与杂质蛋白沉淀分离

□ 温度：4℃

□ 离心力：9915g
时长：30min
留存：上清液

目的
将样品中的盐脱去
层析原理
- 分子筛
- 填料性质
  - 名称：Sephadex G 25
- 缓冲液
  - 平衡缓冲液、洗脱缓冲液
    - 10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA pH 8.0±0.2
- 最终蛋白质缓冲体系
  
  □ 1
DEAE1
层析原理

□

目的

□

离子交换（弱阴离子交换）

捕获目的蛋白

填料性质
- 名称：DEAE Sephrose F.F
- 缓冲液
  - 平衡缓冲液
    - 0.3mol/L Tris-HCl-30m mol/L EDTA
    - 0.04mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
  - 样品调节缓冲液
    - 0.04mol/L NaCl -10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
  - 冲洗缓冲液
    - 0.04mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
  - 洗脱缓冲液
Phenyl
0.1mol/L NaCl-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
层析原理
- 疏水
- 填料性质
  - 名称：Phenyl Sepharose F.F
- 缓冲液
  - 平衡缓冲液
    - 0.7mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
  - 样品调节缓冲液？？？
    - 3.5mol/L (NH4)2SO4溶液、1mol/L Tris-HCl-100mmol/L EDTA
  - 冲洗缓冲液
    - 0.7mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
  - 洗脱液
    - 0.5mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
    - 0.35mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
    - 0.05mol/L (NH4)2SO4-10m mol/L Tris-HCl-1m mol/L EDTA
盐析（去除硫酸铵、Tris，缩小体积）
盐析

□

目的：使蛋白沉淀出来温度：？

硫酸铵用量：3.5mol/L硫酸铵溶液→硫酸铵终浓度：1.35mol/L～1.83mol/L 时长：10min

一次离心
- 目的：使蛋白沉淀与杂质溶液分离
  
  □ 温度：4℃
  
  □ 离心力：9910g
  - 时长：30min
  - 留存：蛋白沉淀
- 蛋白溶解
  - 目的：使蛋白沉淀溶解
  - 溶解液：5m mol/L PB pH 7.2±0.1
  - 蛋白浓度：35mg/ml~50mg/ml
- 二次离心
  - 目的：使目的蛋白溶液与杂质蛋白沉淀分离
    
    □ 温度：4℃
    
    □ 离心力：9910g
S-100
时长：15min
留存：上清液
层析原理
- 分子筛
- 填料性质
  - 名称：Sephacryl S100 H.R
  - 排阻范围：1~100KD
- 缓冲液
  - 平衡缓冲液、洗脱缓冲液



步骤
- 平衡
  - 上样
  - 洗脱
  - 收集
1. mol/L NaCl-5m mol/L PB
DEAE2
目的

□